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Volume 39 Issue 2
Mar.  2021
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WANG Dongsheng, ZHENG Sili, CHENG Minghe, MIAO Chaoyu. Effect of nicotinamide mononucleotide on mortality of mice with endotoxic shock[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2021, 39(2): 134-137, 142. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202102006
Citation: WANG Dongsheng, ZHENG Sili, CHENG Minghe, MIAO Chaoyu. Effect of nicotinamide mononucleotide on mortality of mice with endotoxic shock[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2021, 39(2): 134-137, 142. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202102006

Effect of nicotinamide mononucleotide on mortality of mice with endotoxic shock

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202102006
  • Received Date: 2021-02-05
  • Rev Recd Date: 2021-03-10
  • Available Online: 2021-03-31
  • Publish Date: 2021-03-25
  •   Objective  To study the effect of nicotinamide mononucleotide (NMN) on the mortality of the lipopoly-saccharide (LPS)-induced endotoxic shock mouse model.  Methods  10-week-old C57BL/6J male mice were randomly divided into groups, and were injected intraperitoneally (i.p.) with LPS (10 mg/kg) to induce endotoxic shock models. NMN was i.p. injected in three ways: (1) 0.5 h after modeling, doses of 10, 30, 100 and 300 mg/kg; (2) 0.5 h before modeling, doses of 30, 100, 300 and 600 mg/kg; or (3) 0.5 and 12 h after modeling, dose of 300 mg/kg each time. The death times of each group were recorded, and the survival curves were drawn.  Results  Compared with the solvent control group, NMN at different doses given 0.5 h after or before modeling didn’t improve the survival rate or delay the death time of endotoxic shock mice; But when given at 0.5 and 12 h 300 mg/kg after modeling, NMN accelerated the death of mice and increased the mortality of mice. NMN products by two manufacturers showed similar effects.  Conclusion  NMN has no therapeutic effect on LPS-induced endotoxic shock, and repeated administration of NMN after endotoxic shock will increase the mortality.
  • [1] YOSHINO J, BAUR J A, IMAI S I. NAD+ intermediates: the biology and therapeutic potential of NMN and NR[J]. Cell Metab,2018,27(3):513-528. doi:  10.1016/j.cmet.2017.11.002
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Effect of nicotinamide mononucleotide on mortality of mice with endotoxic shock

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202102006

Abstract:   Objective  To study the effect of nicotinamide mononucleotide (NMN) on the mortality of the lipopoly-saccharide (LPS)-induced endotoxic shock mouse model.  Methods  10-week-old C57BL/6J male mice were randomly divided into groups, and were injected intraperitoneally (i.p.) with LPS (10 mg/kg) to induce endotoxic shock models. NMN was i.p. injected in three ways: (1) 0.5 h after modeling, doses of 10, 30, 100 and 300 mg/kg; (2) 0.5 h before modeling, doses of 30, 100, 300 and 600 mg/kg; or (3) 0.5 and 12 h after modeling, dose of 300 mg/kg each time. The death times of each group were recorded, and the survival curves were drawn.  Results  Compared with the solvent control group, NMN at different doses given 0.5 h after or before modeling didn’t improve the survival rate or delay the death time of endotoxic shock mice; But when given at 0.5 and 12 h 300 mg/kg after modeling, NMN accelerated the death of mice and increased the mortality of mice. NMN products by two manufacturers showed similar effects.  Conclusion  NMN has no therapeutic effect on LPS-induced endotoxic shock, and repeated administration of NMN after endotoxic shock will increase the mortality.

WANG Dongsheng, ZHENG Sili, CHENG Minghe, MIAO Chaoyu. Effect of nicotinamide mononucleotide on mortality of mice with endotoxic shock[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2021, 39(2): 134-137, 142. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202102006
Citation: WANG Dongsheng, ZHENG Sili, CHENG Minghe, MIAO Chaoyu. Effect of nicotinamide mononucleotide on mortality of mice with endotoxic shock[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2021, 39(2): 134-137, 142. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202102006
  • 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是一种经典辅酶,对线粒体电子转移反应至关重要,在许多生物学功能中起着关键作用[1]。烟酰胺单核苷酸(NMN)是NAD生物合成的关键中间体。NMN在心脑血管疾病、肝肾功能、血管和内皮功能,以及免疫和炎症、衰老等各类疾病治疗方面都具有相当强的潜力[2],常被人称为“万能药”。NMN能够通过口服、静脉注射、腹腔注射(小鼠)等多种给药途径进入体内,通常具有较高的安全性。在急性毒性实验中,小鼠连续7 d给予最大灌胃剂量和饱和浓度的NMN,每天1次,耐受性良好,除血清丙氨酸氨基转移酶略有升高外,其余生物标志物基本保持不变,而相同处理条件下的比格犬,会有轻度的肌酐和尿酸升高[3];在长期给药实验中,小鼠连续12个月给予100和300 mg/kg的NMN,均未出现不良反应[4]。在出血性休克治疗方面,对出血性休克大鼠模型,术前连续5 d的NMN饮水给药和术后静脉推注NMN均能缩短休克复苏时间和提高复苏后的存活率[5]。据报道[6-9],在炎症治疗方面,NMN及相关代谢产物烟酰胺核糖、烟酰胺都具有一定抗炎作用。

    内毒素休克是由感染引起的全身炎症反应综合征,会导致各系统衰竭,包括循环系统、呼吸系统、血液系统,损害肝脏和肾脏功能[10]。相关研究显示,最佳的治疗时间在发病6 h内,能够提高患者的生存率,降低病死率[11]。目前临床内毒素休克以药物治疗为主(如血管活性药物、激素、抗菌素等)[12],同时辅以液体复苏、脑神经保护、吸氧等常规治疗。为便于对内毒素休克开展研究治疗,通常使用LPS进行内毒素休克动物造模,LPS是G-菌细胞壁外膜上的主要成分,也叫内毒素,能引起严重的炎症级联反应,是G-菌的主要致病成分之一[13]

    目前,NMN对内毒素休克的治疗作用尚未知。本研究旨在探究NMN对LPS诱导的内毒素休克小鼠模型的死亡率影响,为阐明NMN在内毒素休克治疗方面的作用提供线索。

  • 烟酰胺单核苷酸[NMN,纯度≥95%,−25~−15 ℃保存,邦泰生物工程(深圳)有限公司];烟酰胺单核苷酸[NMN~,纯度≥95%,2~8 ℃保存,尚科生物医药(上海)有限公司];脂多糖(LPS,美国Sigma公司);BT25S精密电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司];独立通风系统(上海鸣励实验室科技发展有限公司)。

  • SPF级8周龄雄性C57BL/6J小鼠(西普尔-必凯实验动物有限公司)。实验前在相对洁净的环境下使用独立通风系统,将动物适应性饲养2周。期间动物自由饮水、进食。笼具内温度22~26 ℃、湿度40%~70%,笼内维持正压20~25 Pa,每小时换气次数60~70次,室内明暗交替12 h(8:00~20:00照明)。

  • 根据不同实验目的,将C57BL/6J小鼠随机分为给药组和对照组。腹腔注射LPS(10 mg/kg)进行内毒素休克造模,在造模前或者造模后进行NMN腹腔注射给药,给药方式分为单次给药和两次给药方式。具体分成5个实验:①造模后0.5 h给药,剂量为10、30、100、300 mg/kg;②造模前0.5 h给药,剂量为30、100、300、600 mg/kg;③造模后0.5 h和12 h两次给药,每次300 mg/kg;④造模后0.5 h和12 h分别用2种不同厂家的NMN给药,剂量为300 mg/kg;⑤造模前0.5 h用不同厂家的NMN给药,剂量为300 mg/kg。

  • 使用Log-rank检验,对给药组和溶剂对照组的生存曲线进行比较,P<0.05为差异有统计学意义,使用GraphPad Prism8软件对数据进行统计分析。

  • 图1所示,LPS造模后0.5 h给予300 mg/kg NMN组小鼠首次出现死亡的时间比生理盐水组更早,整个观察期间给药组小鼠死亡的总体趋势要稍快于生理盐水组,且在观察末期存活的动物数量略少。但两组生存曲线之间比较无统计学差异(P=0.2161)。因此,LPS造模后0.5 h给予300 mg/kg NMN不具有治疗内毒素休克的作用,甚至有轻微增加内毒素休克死亡率的趋势。

    实验进一步考察了LPS造模后0.5 h给予多个不同剂量NMN对内毒素休克死亡率的影响,如图2所示,与生理盐水组相比,10、30、100、300 mg/kg NMN给药组的小鼠首次出现死亡的时间均接近,各组中位生存时间:300、100、30、10 mg/kg给药组分别为51、55、41和38 h,生理盐水组为37 h。整个观察期间NMN给药各组死亡速度较生理盐水组稍缓,其中放缓趋势最明显的是100 mg/kg剂量组,但均不具有统计学意义(P=0.4334),表明小鼠在LPS造模后0.5 h单次给予NMN不能改善内毒素休克死亡率或减缓死亡速度。

  • 在LPS造模前0.5 h进行NMN给药。如图3所示,300 mg/kg NMN预防给药组小鼠首次出现死亡的时间稍早于生理盐水组,而2组死亡的总体趋势相近,前者的中位生存时间为83 h,后者为91 h,生存曲线比较无统计学差异(P=0.5946),故LPS造模前0.5 h给予300 mg/kg NMN不能改善内毒素休克小鼠的死亡率,不具有防治作用。

    随后又进行多个不同剂量NMN单次预给药实验。如图4所示,NMN 30、100、300、600 mg/kg组与生理盐水组小鼠首次出现死亡的时间均相近,之后各组死亡趋势也类似,各组中位生存时间分别是:NMN给药组30 mg/kg为34 h、100 mg/kg为43 h、300 mg/kg为40 h、600 mg/kg为55 h,生理盐水组为37 h,各组生存曲线也无统计学意义。结果表明,在造模前进行NMN单次预给药对于LPS构建的内毒素休克模型无明显改善生存率的作用。

  • 考虑到NMN在体内的代谢速度较快,能够迅速入血进入各个组织器官并代谢为活性分子NAD,而NAD被证明在多种炎症性疾病中具有保护作用,因此,观察NMN的2次给药是否对内毒素休克有治疗效果。

    图5所示,2次重复实验结果均表明,LPS造模后0.5 h和12 h,给予2次NMN(每次300 mg/kg)治疗组小鼠其首次出现死亡的时间早于生理盐水组;之后,NMN治疗组小鼠死亡速度明显快于对照组,且观察末期NMN治疗组小鼠存活率不及对照组一半,2次重复实验的生存曲线间均具有统计学差异(P=0.0404;P=0.0038)。因此,该结果表明,LPS造模后2次NMN给药明显增加小鼠内毒素休克死亡率。

  • 不同厂家生产的NMN因药物纯度、杂质成分不同等,可能导致治疗效果有差别。为排除非药物分子本身因素如厂家生产工艺因素,进一步明确上述NMN治疗内毒素休克的作用,接着引入另一厂家生产的NMN(以下均简称NMN~),并同时测试比较两家NMN产品治疗内毒素休克的效果。

    实验首先对LPS造模后0.5 h和12 h的2次给予NMN(每次300 mg/kg)增加内毒素休克死亡率的作用进行了验证。如图6所示,NMN给药组和NMN~给药组这2组小鼠首次出现死亡的时间和观察末期小鼠存活数都接近,整个观察期小鼠死亡趋势非常相似,与生理盐水对照组相比,两组都明显加重内毒素休克小鼠的死亡率,与对照组的生存曲线间均有统计学差异(P=0.0499;P=0.0260)。3组中位生存时间分别是:NMN给药组57.5 h、NMN~给药组51.5 h、生理盐水组106.5 h。此外,该结果与上述单个NMN产品连续2次给药效果类似(图5)。因此,两家NMN产品效果基本相同,也进一步证明了LPS造模后0.5 h和12 h的2次给予NMN(每次300 mg/kg)确实可加重内毒素休克病情,加速小鼠的死亡。

    最后,实验又考察了两家NMN产品预防给药效果,即在LPS造模前0.5 h进行NMN或NMN~给药。如图7所示,NMN组、NMN~组、生理盐水组3组小鼠首次出现死亡的时间及之后每组小鼠死亡的速度都相近,直至每组均剩20%小鼠存活(第71小时)。之后,生理盐水组小鼠不再死亡,而NMN组、NMN~组小鼠陆续死亡殆尽。3组中位生存时间分别是:NMN给药组40 h、NMN~给药组45 h、生理盐水组37 h。可见,两家NMN产品作用相似,对LPS所致的内毒素休克无治疗效果,且与生理盐水组比较时均有加重内毒素休克死亡率的趋势,但是均无统计学意义(P=0.6447;P=0.9725)。该结果与上述NMN单次预防给药的实验结果相一致(图3图4)。

  • 目前NMN是保健品领域的开发热点,以抗衰老以及各类疾病治疗作用为目的,在国内外已有不少人开始服用NMN[14]。但是NMN对内毒素休克的作用尚未知,对患有这种疾病的患者能否服用NMN亦不清楚。

    根据现有的研究报道,NMN在小鼠疾病模型其腹腔注射给药的有效剂量为10~600 mg/kg[2, 4]。本实验中,我们测试了不同NMN剂量尤其是300 mg/kg时对小鼠内毒素休克的治疗效果,结果显示,小鼠在LPS造模后0.5 h或造模前0.5 h单次给予不同剂量NMN均无明显改善生存率的作用,不具有治疗效果;甚至在LPS造模后两次NMN给药明显增加小鼠内毒素休克死亡率。为排除厂家生产工艺等因素,我们又同时用两个厂家生产的NMN产品进行实验,以重复上述结果,最终再次证明LPS造模后两次给予NMN确实可加速小鼠的死亡,增加死亡率。

    因此,本次实验结果表明,NMN在某些疾病尚未证明其安全性的情况下,应谨慎推广,尤其是内毒素休克的患者,应慎用甚至是禁用NMN治疗。

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