Metabolomics study of dihydrotanshinone <b>Ⅰ</b> on hepatic fibrosis with LC-MS technology

TAO Chaoyang; ZHU Zhenyu; XING Xinrui; CAO Qi; WANG Hui

doi:10.12206/j.issn.1006-0111.202101035

Volume 39 Issue 5

Sep. 2021

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TAO Chaoyang, ZHU Zhenyu, XING Xinrui, CAO Qi, WANG Hui. Metabolomics study of dihydrotanshinone Ⅰ on hepatic fibrosis with LC-MS technology[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2021, 39(5): 403-408, 471. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202101035

Citation:

TAO Chaoyang, ZHU Zhenyu, XING Xinrui, CAO Qi, WANG Hui. Metabolomics study of dihydrotanshinone Ⅰ on hepatic fibrosis with LC-MS technology[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2021, 39(5): 403-408, 471. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202101035

Metabolomics study of dihydrotanshinone Ⅰ on hepatic fibrosis with LC-MS technology

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202101035

1.
Research Center of Pharmaceutical Preparation, Tibet Military General Hospital., Lhasa 8500771, China
2.
Department of Pharmacy, Naval Medical University, Shanghai 200433, China

Received Date: 2021-01-30
Rev Recd Date: 2021-07-20

Available Online: 2021-09-28

Publish Date: 2021-09-25

Abstract

Objective To evaluate therapeutic effects of dihydrotanshinone Ⅰ on hepatic fibrosis based on liver metabolomics method. Methods 28 rats were randomly divided into four groups including control group, hepatic fibrosis model group and dihydrotanshinone Ⅰ low dose group and dihydrotanshinone Ⅰ high dose group. The dihydrotanshinone Ⅰ treated groups received dihydrotanshinone Ⅰ for 28 days. The rat liver samples were collected and analyzed by liquid chromatography-mass spectrometer (LC-MS). The OPLS-DA pattern recognition analysis of metabolomics differences among the groups and therapeutic effects of dihydrotanshinone Ⅰ on hepatic fibrosis were evaluated. Results 38 metabolites were identified through liver metabolomics analysis. The possible mechanism of hepatic fibrosis was mainly involved glutathione metabolism, melatonin metabolism, amino acid metabolism, lipid metabolism and TCA cycle. The hepatic fibrosis induced by TAA was reversed by dihydrotanshinone Ⅰ. Conclusion Dihydrotanshinone Ⅰ provided satisfactory therapeutical effects on hepatic fibrosis through partially regulating the perturbed glutathione metabolism, melatonin metabolism, amino acid metabolism, lipid metabolism, TCA cycle.
- hepatic fibrosis,
- dihydrotanshinone I,
- LC-MS,
- metabolomics

References

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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com

1.
沈阳化工大学材料科学与工程学院沈阳 110142

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肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是以肝内细胞外基质（extracellular matrix protein，ECM）过度沉积和纤维瘢痕形成为特征的慢性肝病，在世界范围内具有较高的发病率和病死率，持续发展导致肝硬化、肝癌的发生^[1]。肝纤维化发病机制复杂，病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、胆汁淤积性肝病等均可能导致慢性肝炎症，并最终导致肝纤维化^[2]。然而，除肝移植外，目前尚无有效治疗肝纤维化的方法，针对肝纤维化早期识别和治疗对于预防相关负面后果至关重要。鉴于肝脏是人体最大的器官和主要代谢枢纽，探讨肝纤维化的代谢特征有望发现新的标志物和治疗靶点。

二氢丹参酮Ⅰ（dihydrotanshinone I，DHI）是中药丹参中的亲脂性成分，被认为是一种潜在的治疗肝纤维化的药物，其肝脏保护作用、抗癌作用、抗流感活性、抗炎作用等生物学功能已多次报道^[3-5]。在本课题组前期扶正化瘀方抗肝纤维化机制研究中发现DHI是扶正化瘀胶囊的重要药效物质基础，也在细胞活性实验中证明其能显著抑制细胞活性发挥抗肝纤维化作用^[6]。然而，DHI对肝纤维化治疗作用的体内药效及机制尚不明确。本研究利用肝脏代谢组学方法研究肝纤维化密切相关的生物标志物，探索肝纤维化相关病理过程，同时采用DHI进行干预，研究其对肝纤维化的治疗作用及作用机制，为肝纤维化早期诊断、有效治疗提供科学依据。

1. 材料

1.1. 仪器

METTLER AE240 型电子天平（瑞士梅特勒公司）；FRESCO17台式冷冻离心机 (Thermo Fisher，美国)；DZG-6020真空干燥箱 (上海益恒实验仪器公司)；Agilent 1290 Infinity 液相色谱仪、Agilent 6538 Q-TOF/MS 质谱仪、Micro17高速离心机（Thermo Fisher Scientific，美国）；HSS T₃柱（2.1 mm×100 mm，2.5μm）(Waters，美国)。

1.2. 试药

DHI（纯度 98%，上海一飞生物科技有限公司）；硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA，东京化成工业株式会社)；甲醇、乙腈（均为色谱纯，德国Merck公司），甲酸（色谱纯，ROE scientific INC，美国）；水为实验室制备的超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.3. 实验动物

SD大鼠，雄性，质量(200～250 g)，共28只，购自中国科学院上海实验动物中心，合格证号：SCXK(沪)2012-0002。饲养于海军军医大学实验动物中心，遵循动物实验的标准操作规范。饲养条件：温度（22±2）℃，相对湿度40%～60%，12 h昼夜交替循环的条件下笼养。

2. 方法

2.1. 动物模型的构建和治疗

将28只雄性SD大鼠随机分为4组：正常组、肝纤维化模型组、DHI低剂量组和DHI高剂量组，每组7只。24 h适应性饲养后，除正常组外，模型组及不同用药剂量干预组每周3次腹腔注射200 mg/kg TAA，持续给TAA造模8周；同时，自第5周起，按照给药剂量持续给药4周：正常组、模型组，每日给予生理盐水10 ml/kg；DHI低剂量组，每日给予DHI15 mg/kg；DHI高剂量组，每日给予30 mg/kg。

2.2. 样品收集

最后一次给药24 h后，采用脊椎脱臼法处死大鼠。快速切除肝脏后，用0 ℃生理盐水冲洗并立即放于液氮中快速冷冻，储存于−80 ℃冰箱直至分析。

2.3. 样品制备

将冻存的肝脏组织置于室温自然解冻，取约100 mg肝脏样本于匀浆管中，加入800μl甲醇，在60 Hz下充分匀浆至没有纤维颗粒，4 ℃离心15 min（14 500×g）后取上清液置于1.5 ml的离心管中，氮气吹干。在上述氮气吹干的样品残渣中加入300 μl含内标甲醇涡旋30 s（内标为L-2-氯苯丙氨酸，浓度为5 μg/ml），每个样品取10μl混匀作为质量控制样品。

2.4. LC-MS分析

色谱条件：Agilent 1290 Infinity UHPLC，色谱柱：Waters XSelect HSS T3 column色谱柱，柱温：30 ℃；进样量：3 μl；流动相A：含0.1 %甲酸的水，流动相B：含0.1 %甲酸的乙腈。流速：0.4 ml/min；梯度洗脱条件：0～2 min，2 %B，2～17 min，2 %～98 % B，17～19 min，98 %B。质谱条件：Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF/MS，离子源：电喷雾（ESI）离子源，正、负离子检测模式；干燥气温度：350 ℃，干燥气体流量：11 L/min；碎裂电压：120 V；毛细管电压：4 000 V（ESI+）/3 500 V（ESI-）；质谱扫描范围：50～1 500 m/z。

2.5. 数据分析

2.5.1. 数据处理

将采集的质谱数据转换为mzData格式文件，然后通过R软件XCMS程序将质谱数据转化为含有保留时间、质核比、峰强度的数据矩阵。保留频数超过80%的质核比数据，并对所有峰面积以内标峰面积和肝组织质量进行归一化处理。

2.5.2. 差异代谢物筛选

将上述获得的二维矩阵列表导入SIMCA 14.1软件中进行多元统计分析，采用正交偏最小二乘判别分析研究各组间差异，并得到变量VIP值。正常组和模型组组间比较采用独立样本t检验，采用VIP>1，且选择差异具有显著性（P<0.05）的变量作为潜在的差异代谢物，然后检索数据库（HMDB、METLIN、KEGG数据库），筛选出潜在的差异代谢物。

2.5.3. 统计学分析

使用SPSS 21.0统计软件进行数据统计分析，组间数据采用单因素方差分析（ANOVA），两组样本分析采用独立样本t检验，分析数据差异的统计学意义，以P<0.05为差异有统计学意义。

4. 讨论

4.1. 研究意义

肝纤维化是一种发病机制复杂，可导致肝硬化、肝衰竭甚至肝癌等严重肝脏疾病的慢性流行肝病，然而目前并没有药物可以治疗肝纤维化，中药及其活性成分由于其多靶点、多通路等特点被认为是肝纤维化治疗的潜在药物。代谢组学可以对生物体内小分子代谢产物进行动态分析，通过分析阐述代谢物与生理病理变化间的联系，对肝纤维化的机制进一步阐述，也能通过肝纤维化相关差异代谢物的含量相对变化分析药物对肝纤维化模型的药效作用。本研究用肝脏代谢组学方法分析了与TAA诱导的肝纤维化模型密切相关的38种代谢物，主要涉及谷胱甘肽代谢、褪黑素代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、三羧酸循环等途径，DHI能够通过调节部分代谢通路发挥预防和治疗肝纤维化作用。

4.2. 谷胱甘肽代谢

肝纤维化的产生伴随着肝细胞死亡和肝星状细胞(HSCs)的活化，HSCs约占正常人肝脏中非实质细胞的1/3和总驻留细胞的15%，HSCs从静态到激活会使得ECM过剩表达而导致纤维化，而氧化应激在HSCs激活和ECM形成中发挥重要的促进作用^{[1, 8]}。谷胱甘肽（GSH）是人体内含量最丰富的抗氧化剂，也是体内氧化防御体系的主要组成成分之一^[9]。GSH可以在谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽-S-转移酶以及谷胱甘肽还原酶的作用下与其氧化态相互转换，清除部分有机过氧化物，调节体内的氧化还原稳态，缓解氧化应激对组织造成的损伤^[10-11]。有研究表明，在对乙酰氨基酚、四氯化碳、重金属砷等诱导下，大鼠肝组织中GSH含量下降^[12]。本研究中，TAA诱导的肝纤维化大鼠模型肝组织中GSH显著下降，这与谷胱甘肽在其他肝损模型中下调的趋势一致。经过DHI干预后GSH回调，且高剂量DHI比低剂量组回调比例更大，这说明DHI可能调整体内谷胱甘肽代谢通路，通过提高体内谷胱甘肽含量恢复肝组织抗氧化功能，缓解氧化应激对肝脏的进一步损伤，从而起到抗肝纤维化作用。

4.3. 褪黑素代谢

肝纤维化过程中，抑制HSC的激活和增殖是预防和治疗肝纤维的重要途径。血小板衍生生长因子(PDGF)可以激活JAK2/STAT3信号通路，致使HSC增殖，并抑制HSC凋亡^[13]。已有研究证明，褪黑素通过抑制JAK2/STAT3相关信号通路或抗氧化机制来抑制HSC的激活和增殖从而发挥肝脏保护作用^[14-15]。在本研究中，环6-羟基褪黑素及N-乙酰血清素硫酸盐均为褪黑素代谢产物，在模型组中含量显著增加，说明褪黑素被大量代谢，肝脏保护作用被抑制。经过DHI的干预后两种褪黑素代谢产物均回调，这提示DHI可能通过调整褪黑素代谢，回调褪黑素及其代谢产物的机体内含量发挥抗肝纤维化活性。

4.4. 氨基酸代谢

肝脏是机体物质代谢的中枢器官，在氨基酸的新陈代谢和蛋白质的合成与分解中发挥重要作用。天冬氨酸是一种酸性氨基酸。天冬氨酸在哺乳动物中一般被认为是一种营养上非必需的氨基酸。然而，越来越多的文献表明，天冬氨酸在包括肝脏生理学在内的许多生物和生理过程中起着重要作用，如合成精氨酸以维持巨噬细胞应对免疫挑战，同时，也有证据表明天冬氨酸可以减轻肝损伤、增强肝脏功能^[16]。本研究发现TAA诱导大鼠肝纤维化后，与正常组比较，模型组中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路被干扰，L-天冬氨酸含量显著变化，经过DHI的干预后回调，这提示DHI可能调整丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路，改变体内天冬氨酸含量发挥肝保护作用。

4.5. 脂质代谢

脂质不仅是细胞膜的组成成分，而且参与信号转导。磷脂酰胆碱、鞘脂、溶血性磷脂酰胆碱是血清脂蛋白和细胞膜的重要组成成分。溶血磷脂酰乙醇胺是磷脂酶A₁水解磷脂酰乙醇胺(PE)失去一分子脂肪酸生成的产物，作为一种溶血卵磷脂，在肝脏中与卵磷脂一起在线粒体间进行转移^[17]。有研究证明，PE通过N-甲基转移酶生成PC的通路约占PC产生量的30%，磷脂酰胆碱为肝脏重要营养来源，可以拮抗肝脏受病毒、药物、酒精及其他有毒物质的侵害，防止肝纤维化^[9]。肝脏是脂质生成和脂肪酸氧化等脂类代谢的主要场所，肝纤维化时可以引起脂质合成、转运及分解代谢的普遍紊乱，而脂质代谢异常又会加重肝损害，引起肝脏的脂毒性^[18]。在本研究中，4种LysoPE在模型组中均发生下降，另外一些磷脂代谢相关物质，如GlcCer(d18:1/12:0)、PE(16:0/P-16:0)、PE(18:0/15:0)、CL(i-13:0/i-22:0/i-12:0/i-13:0)和脂质代谢相关物质如二酰甘油（DG）、甘油磷酸甘油、牛磺酸熊去氧胆酸等在正常组与模型组大鼠中也存在显著差异，说明TAA诱导的大鼠肝纤维化模型脂质代谢的紊乱。经过DHI干预治疗后，代谢物水平不同程度得到回调，表明DHI可通过干预多个脂质代谢通路发挥其抗肝纤维化活性。

4.6. 能量代谢

三羧酸循环是糖、脂肪、氨基酸三大营养素的最终代谢通路，在能量代谢、提供生物合成的前体中起重要作用。琥珀酸既是三羧酸循环的的重要中间产物，也是一种重要的细胞外信号分子，在信号传递、炎症反应、肝纤维化的发生发展中发挥着重要作用^[19]。在本研究中，肝纤维化模型组大鼠琥珀酸的代谢变化趋势均与正常大鼠相反，而给予DHI后趋近正常，说明DHI能够改善肝纤维化大鼠的能量代谢。

5. 结论

本研究建立了LC-MS代谢组学分析的方法，通过OPLS-DA筛选出与肝纤维化密切相关的38种差异代谢产物，主要涉及谷胱甘肽代谢、褪黑素代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、三羧酸循环等途径。基于38种差异代谢物在正常组、模型组及DHI给药组之间相对含量的差异，对DHI预防治疗大鼠肝纤维化模型的药效进行了评价，结果表明DHI能够回调34种潜在差异代谢物的相对含量，调节部分失衡代谢通路，发挥抗肝纤维化作用。本研究为肝纤维化的新标志物和治疗靶点的发现以及DHI作为抗肝纤维化潜在药物的进一步开发应用提供实验依据。

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编号	代谢物	精确分子量	加合离子	分子式	调节趋势	相关通路
1	丁二酸	118.026 6	M-H	C₄H₆O₄	↓^*	TCA循环
2	柠檬酸	130.026 6	M+NH4	C₅H₆O₄	↑^**	脂肪酸代谢
3	戊二酸	130.026 6	M+FA-H	C₅H₆O₄	↓^***	/
4	L-天冬氨酸	133.037 5	M-H	C₄H₇NO₄	↑^*	丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢
5	丝氨酸甘氨酸	162.064 1	M+H-H2O	C₅H₁₀N₂O₄	↑*	二肽
6	左旋肉碱	162.113 0	M+H	C₇H₁₆NO₃	↓^**	肉碱合成
7	2-甲基-3-苯基丙酸	164.083 7	M+H-H2O	C₁₀H₁₂O₂	↑^***	/
8	顺乌头酸	174.016 4	M-H	C₆H₆O₆	↓^**	三羧酸循环
9	半胱氨酰甘氨酸	178.041 2	M+H	C₅H₁₀N₂O₃S	↓^***	谷胱甘肽代谢
10	缬氨冬酰胺	231.121 9	M+NH4	C₉H₁₇N₃O₄	↓^*	二肽
11	尿苷	244.069 5	M-H	C₉H₁₂N₂O₆	↓^**	嘧啶代谢
12	甘油磷酸甘油	246.050 5	M-H	C₆H₁₅O₈P	↓^**	脂质代谢
13	环状6-羟基褪黑素	246.100 4	M+Na	C₁₃H₁₄N₂O₃	↓^**	褪黑素代谢
14	7,8-二氢蝶呤	255.096 8	M+H	C₉H₁₃N₅O₄	↓^*	蝶呤生物合成
15	谷氨酰胺天冬酰胺	261.096 1	M+Na	C₉H₁₅N₃O₆	↑^***	二肽
16	γ-谷氨酰鸟氨酸	261.132 5	M+NH4	C₁₀H₁₉N₃O₅	↑^***	二肽
17	3-羟基异戊酰肉碱	261.1576	M+NH4	C₁₂H₂₃NO₅	↓^***	脂肪酸代谢
18	天冬氨酰谷氨酸	262.080 1	M+FA-H	C₉H₁₄N₂O₇	↓^***	二肽
19	N-乙酰5-羟色胺硫酸盐	298.062 3	M-H20-H	C₁₂H₁₄N₂O₅S	↓^***	褪黑素代谢
20	视黄酯	302.224 6	M-H	C₂₀H₃₀O₂	↓^*	脂肪酸代谢
21	谷胱甘肽	307.083 8	M+H	C₁₀H₁₇N₃O₆S	↓^**	谷胱甘肽代谢
22	吲哚酚葡萄糖醛酸苷	309.084 9	M+H	C₁₄H₁₅NO₇	↓^**	脂质代谢
23	3'-AMP	347.063 1	M+H	C₁₀H₁₄N₅O₇P	↓^*	胆酸生物合成
24	苯酰甘氨酸	397.355 6	M+Na	C₂₄H₄₇NO₃	↑^*	脂肪酸代谢
25	花生四烯酰肉碱	448.342 1	M+H	C₂₇H₄₆NO₄	↓^**	脂质代谢
26	花生四烯基肉碱	455.397 5	M+H-H2O	C₂₇H₅₃NO₄	↑^**	脂肪酸代谢
27	溶血磷脂酰乙醇胺(0∶0/18∶2(9Z,12Z))	477.285 5	M+H	C₂₃H₄₄NO₇P	↓^*	甘油磷脂代谢
28	溶血磷脂酰乙醇胺(18∶2(9Z,12Z)/0∶0)	477.285 5	M-H	C₂₃H₄₄NO₇P	↓^*	甘油磷脂代谢
29	溶血磷脂酰乙醇胺(0∶0/20∶5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z))	499.269 9	M+FA-H	C₂₅H₄₂NO₇P	↓^*	甘油磷脂代谢
30	牛磺熊去氧胆酸	499.296 8	M-H	C₂₆H₄₅NO₆S	↓^*	脂质代谢
31	溶血磷脂酰乙醇胺(20∶4(8Z,11Z,14Z,17Z)/0∶0)	501.285 5	M+H	C₂₅H₄₄NO₇P	↓^*	甘油磷脂代谢
32	二酰甘油(16∶1n7/0∶0/18∶3n3)	588.475 4	M+H-H2O	C₃₇H₆₄O₅	↑^***	脂质代谢
33	二酰甘油(14∶0/0∶0/22∶5n3)	614.491 0	M+H	C₃₉H₆₆O₅	↑^***	脂质代谢
34	磷脂神经酰胺(d18∶1/16∶0)	617.478 4	M+H-H2O	C₃₄H₆₈NO₆P	↑^***	鞘脂代谢
35	鞘糖脂(d18∶1/12∶0)	643.502 3	M+H	C₃₆H₆₉NO₈	↑^***	磷脂代谢
36	磷脂酰乙醇胺(16∶0/P-16∶0)	675.520 3	M+H-H2O	C₃₇H₇₄NO₇P	↑^**	磷脂代谢
37	磷脂酰乙醇胺（18∶0/15∶0）	705.530 9	M+H-H2O	C₃₈H₇₆NO₈P	↑^***	磷脂代谢
38	心磷脂(i-13∶0/i-22∶0/i-12∶0/i-13∶0)	1 296.909 6	M+H-H2O	C₆₉H₁₃₄O₁₇P₂	↓^*	磷脂代谢
^P<0.05、^P<0.01、^**P<0.001，模型组与正常组比较

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