Simultaneous determination of seven components in Piqin oral liquid by dual-wavelength HPLC

Agilent 1200 Series高效液相色谱系统（含DAD检测器，美国Agilent公司）；AUX220电子分析天平（日本岛津公司）。

枇芩口服液（自制，批号：20200220、20200224、20200315）；黄芩苷对照品（批号：110715-201821，含量95.4%）、黄芩素对照品（批号：111595-200905，含量98.5%）、绿原酸对照品（批号：110753-201415，含量96.2%）、芍药苷对照品（批号：110736-201337，含量94.9%）、甘草酸铵对照品（批号：110731-201418，含量93.1%），咖啡酸对照品（批号：110885-200102）、汉黄芩素对照品（批号：111514-200403，含量98.0%）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯，TEDIA公司，批号：18085030）。

Agilent Zorbax SB-C₁₈(250 mm×4.6 mm，5μm)为色谱柱；流动相：0.02%磷酸水溶液(A)–乙腈(B)梯度洗脱，洗脱程序：0～10 min，10%B；10～20 min，10%～20%B；20～30 min，20%～25%B；30～40 min，25%～30% B；40～50 min，30%～40% B；50～60 min，40%～70% B； 60～65 min，70%～30% B；65～70 min，30%～10%B；流速：1.0 ml/min；柱温：35 ℃；进样量：20 μl。

检测波长：0～18.0 min，325 nm（检测绿原酸、咖啡酸）；18.0～65.0 min，280 nm（检测芍药苷，黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵、汉黄芩素）。

分别称取各对照品适量，精密称定，加甲醇制成含绿原酸355.9 μg/ml、咖啡酸550.0 μg/ml、芍药苷1480 μg/ml、黄芩苷772.7 μg/ml、黄芩素660.0 μg/ml、甘草酸铵642.4 μg/ml和汉黄芩素499.8 μg/ml的单一对照品储备液。精密吸取上述对照品储备液适量，置于同一10 ml的量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度依次为35.59、5.500、296.1、77.27、66.00、128.5和1.999 μg/ml的混合对照品溶液。

精密量取相应批号的枇芩口服液2ml，置10 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。

根据处方中各药的比例，依次制备不含绿原酸（缺茵陈、墨旱莲和枇杷叶）、咖啡酸（缺夏枯草、墨旱莲、枇杷叶和丹参）、赤芍、黄芩和甘草的阴性样品，按“2.2.2”项下供试品溶液制备阴性溶液。

精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件测定，结果见图1。在供试品溶液色谱中，与对照品溶液色谱中绿原酸、咖啡酸、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵和汉黄芩素位置上均有相应的色谱峰出现，且色谱峰之间的分离度均˃1.5，理论板数˃3000。

分别精密吸取对照品储备液0.50、1.00、1.50、2.50、3.50、5.00ml置于5ml棕色量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀。即得系列浓度的混合对照品溶液，按照上述的色谱分析条件进样分析，以浓度（X，μg/ml）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程及线性范围，结果见表1。

精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积。结果显示绿原酸、咖啡酸、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵和汉黄芩素峰面积的RSD分别为1.57%、1.98%、1.74%、1.07%、2.01%、1.41%和1.69%，表明仪器精密度良好。

取同一批样品（批号：20200224）6份，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定峰面积，绿原酸、咖啡酸、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵和汉黄芩素峰面积的RSD分别为1.91%、1.90%、0.68%、1.41%、1.78%、1.40%和1.97%，表明方法重复性良好。

取同一份供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10 h，按“2.1”项下色谱条件进样测定峰面积，绿原酸、咖啡酸、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵和汉黄芩素峰面积的RSD分别为1.05%、1.90%、1.32%、1.06%、1.78%、2.02%和1.87%，结果表明供试品溶液在10 h内稳定。

精密量取已知含量（批号：20200224）的枇芩口服液1ml，共9份，分别按相当于绿原酸、咖啡酸、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵和汉黄芩素含有量的80%、100%、120%加入对照品溶液（不同加入量各3份），按“2.1”项下色谱条件进样，测定含量，并计算加样回收率和RSD，结果见表2。

取3个批号枇芩口服液（批号：20200220、20200224、20200315），按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算7种成分的含量，结果见表3.

试验中选择的7种成分来源于黄芩、夏枯草、茵陈、赤芍和甘草，全面覆盖君、臣、佐、使中的多味药材，将其作为质控指标，以提高质量控制的整体性和特征性。因测定成分绿原酸分别存在于组方中茵陈、枇杷叶等药材中，咖啡酸存在于枇杷叶、丹参等药材中，因此按照相应的方法制备阴性供试品溶液。

试验采用高效液相的DAD检测器分别对7种对照品在200～400 nm处扫描，结果绿原酸和咖啡酸在325 nm波长处有最大紫外吸收，芍药苷，黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵、汉黄芩素在280 nm波长处有最大吸收，因此本实验选择325nm和280 nm作为测定波长。

考察了甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.02%磷酸水溶液等流动相系统，结果采用乙腈-0.02%磷酸水溶液梯度洗脱，对照品溶液与供试品溶液各成分分离度较好，梯度洗脱中基线相对平稳，峰形较好。此外，对柱温、流速、进样量等色谱条件进行优化最终确定色谱条件。