Effects of vitamin K on osteoblastic bone formation and osteoclastic bone absorption

新生3 d的SD大鼠，雌雄不限，购自上海斯莱克实验动物有限公司[SCXK（沪）2012-0002]；II型胶原酶、胰蛋白酶、特级胎牛血清、α-MEM培养基（美国Gibco公司）；CellTriter-blue试剂(美国Promega™)，核刺激因子受体的配体(receptor for activation of nuclear factor kappa B ligand, RANKL，400-30)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF，400-28)购自PEPROTECH公司，淋巴细胞分离液Ficoll-Paque密度梯度液(GE)购自上海生工生物工程技术服务有限公司；TRACP染色试剂盒、Benzyloxycarbonyl-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin (Z-FR-MCA)购自日本WAKO公司；L-3-carboxy-trans-2-3-epoxypropionyl-leucylamido-(4guanidino)-butane(E-64)、硫酸软骨素A (CSA)胃蛋白酶、组织蛋白酶K抑制剂奥当卡替(odanacatib, ODN)、VK₁、MK₄、MK₇和VK₃，购自Sigma公司；I型胶原（美国Affymetrix公司）；牛血清白蛋白、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、多聚甲醛等试剂均为国产分析纯。

实验室自建原代成骨细胞培养方法^[12]。取新生3 d的SD大鼠5只，在无菌条件下取其颅顶盖骨，去除骨膜、血管及结缔组织，用D-Hanks液冲洗干净，用0.25%的胰蛋白酶37 ℃消化30 min，再用0.05%胰蛋白酶及3 mg/ml的II型胶原酶37 ℃消化1 h，经100目滤网过滤，1 000 r/min离心10 min，即为新鲜的成骨细胞，加入10%胎牛血清的α-MEM培养基，置37 ℃，5% CO₂培养箱。取第四代大鼠颅盖骨成骨细胞，消化分离出来，以α-MEM培养基配制成浓度为2×10⁴/ml的细胞悬液，以100 μl/孔接种于96孔培养板，设12个药物组，分别为1、0.1和0.01 μmol/L的VK₁、MK₄、MK₇和VK₃，每组选取1个药物浓度加入1、0.1和0.01 μmol/L的VK₁、MK₄、MK₇和VK₃，培养48 h，用MTT法检测细胞增殖活性。ALP活性需要连续培养6 d后，用100 μl 50 mmol/L的二乙醇胺，50 μl 2.5 mmol/L的对硝基苯酚磷酸二钠，37 ℃反应30 min后，用0.3 mol/L的NaOH终止反应，于波长405 nm处测得吸光度值^[12-13]。

取成骨细胞第三代细胞，按每孔5×10⁴的细胞数接种于12孔板内，α-MEM培养基培养24 h，换骨结节诱导培养基(0.1%BSA，10 nmol/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸钠和50 μg/ml抗坏血酸以及10%胎牛血清的α-MEM培养基)，加入1 μmol/L的VK₁、MK₄、MK₇和VK₃后，每3 d换药1次，连续培养观察14 d后，用0.1%茜素红-Tris-Hcl染液(pH 8.3)染色。染色前，用预冷的10%中性甲醛缓冲液固定10 min，PBS冲洗3次。加入0.1%茜素红-Tris-Hcl染液(pH 8.3)，37 ℃下染色30 min。蒸馏水冲洗，干燥，封片。倒置相差显微镜(Leica DMI 3000)下进行观察并随机拍照10张，用image-Pro Plus (IPP 6.0)分析图片，得出每张图片骨结节面积^[13]。

取新生3 d的SD大鼠胫骨，用α-MEM培养基冲洗骨髓腔以收集骨髓细胞，加入等量Ficoll试剂分离骨髓单核细胞，用含有25 ng/ml M-CSF、25 ng/ml RANKL的细胞因子和10%胎牛血清的α-MEM培养基进行培养，每3 d换液1次，6 d后破骨细胞分化成熟。细胞成熟后，以1×10⁵/ml接种于96孔板，加入1、0.1和0.01 μmol/L的VK₁、MK₄、MK₇和VK₃。继续培养48 h后，取100 μl培养基，加入20 μl CellTriter-blue试剂，轻轻晃10 s混匀，37 ℃孵育30 min后，将96孔板置于荧光分光光度计，检测细胞悬液荧光强度(发散光波长560 nm，吸收光波长590 nm)。

成熟破骨细胞以1×10⁵/ml接种于96孔板内，加入1、0.1和0.01 μmol/L的VK₁、MK₄、MK₇和VK₃，培养48 h后，弃上清液，PBS冲洗2次，20 µl 0.1%Triton X-100室温破碎细胞15 min，加入100 µl反应液(0.4 g对硝基苯基磷酸二钠，去离子水溶解后加入2.0 g酒石酸钾钠，加水溶解至150 ml，HCl调节pH至3.5，再加水定容至200 ml)，于37 ℃反应30 min，迅速加入100 µl 1 mol/L的NaOH终止反应，于波长405 nm处测定其吸光度值^[14]。

25 μmol/L的VK₁、MK₄、MK₇、VK₃和1 μmol/L阳性药Odanacatib用100 mmol/L醋酸钠缓冲液(pH5.5，包含2.5 mmol/L DTT，和2.5 mmol/L EDTA)稀释至浓度为25 μmol/L加入96孔板，最终反应容量为0.2 ml，加入终浓度为5 nmol/L的CTSK孵育5 min，加入5 μl底物1 mmol/L的Z-FR-MCA溶液开始反应，检测5 min荧光信号(发散光波长460 nm，吸收光波长355 nm)。实验设阴性对照，阳性对照(1 μmol/L E-64)。

计算公式：抑制率（%）=100-(1-V_i/V₀)。

V_i和V₀分别表示存在和不存在VK情况下，记录荧光信号强度随时间变化斜率slope值^[11]。

可溶性I型胶原溶解在100 mmol/L醋酸钠缓冲液(pH5.5，包含2.5 mmol/L DTT和2.5 mmol/L EDTA)，最终I型胶原浓度为0.6 mg/ml，加入终浓度100 μmol/L的VK₁、MK₄、MK₇和VK₃及10 μmol/L阳性对照药Odanacatib，依次将CTSK和CSA(终浓度分别为400和200 nmol/L)加入含有I型胶原蛋白的反应液中，使总反应液容量为50 μl。混匀，28 ℃孵育4 h，取出后加入1 μl的100 μmol/L E64终止反应。采用10%的SDS-PAGE凝胶电泳分离，卡马斯亮蓝染色20 min，用乙酸-甲醇(4∶1)脱色。I型胶原的α1条带的灰度用Gene Snap(Syngene Inc.Frederick，MD)软件进行定量分析^[14]。

每组实验重复3次。采用SPSS软件经ANOVA方差分析检验(α=0.05)，再用SNK对每两组进行两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

VK₁和VK₃在0.01~1 μmol/L浓度范围内对成骨细胞增殖和ALP活性均未有影响(图1A、1B)。MK₄在0.01和0.1 μmol/L浓度显著促进了成骨细胞增殖活性，分别提高了15.5%和23.0%(P<0.05)，而MK₇分别提高了25.1%和18.4%。MK₄和MK₇在1 μmol/L显著提高了ALP活性(P<0.05)，促进率分别为30.2%和25.7%。成骨细胞在骨结节诱导培养基培养14 d后，经茜素红染色液染色，骨结节处形成红色钙化晶体，骨结节的面积代表了成骨细胞的钙化程度(图1C)，结果显示MK₄和MK₇在1 μmol/L浓度时显著提高了骨结节形成面积(P<0.05)，分别增加25.2%和34.0%，VK₃显著抑制了骨结节的形成。

由图2A可得，VK₁、VK₃、MK₄和MK₇在0.01~1 μmol/L浓度对破骨细胞代谢活力均无影响，对破骨细胞无毒性。VK₁、MK₄和MK₇在1 μmol/L表现出抑制TRAP活性，抑制率分别为27.4%、54.0%和35.0%，MK₄在0.01和0.11 μmol/L浓度显著降低了破骨细胞TRAP活性(P<0.01)，分别降低了50%和41%，MK₇在0.1 μmol/L浓度时，TRAP活性显著降低26.8%(图2B)。

本研究考察VK₁、VK₃、MK₄和MK₇抑制CTSK与Z-FR-MCA底物结合活性。图3A结果显示，1 μmol/L的ODN抑制了CTSK与Z-FR-MCA底物结合效率达98.3%，而25 μmol/L的VK₃、MK₄、MK₇和VK₁抑制率分别为0.3%、58.9%、16.6%和9.4%。与空白胶原相比，VK₃、MK₄、MK₇和VK₁在100 μmol/L抑制胶原降解效率达30.8%、73.8%、18.4%和19.2% (图3B、3C)，仅有MK₄和ODN超过60%的抑制率，与未加CSA的CTSK阴性对比，抑制率达38.8%、93.0%、23.1%和24.2%。与空白胶原组对比，阳性抑制剂ODN在1 μmol/L的抑制率达77.3%，与未加CSA的CTSK阴性对比，抑制率达到99.0%。

研究报道VK₁、MK₄和MK₇能显著促进成骨细胞活性和抑制破骨细胞活性^[9-10]。临床报道服用高含量维生素K₁能够降低髋部骨折风险和提高髋部及腰椎部骨密度，可延缓50～60岁绝经后女性的骨丢失^[2]。同时药理研究发现VK₃显著促进去卵巢大鼠的骨密度和改善骨质疏松相关指标^[5]。而本研究并未发现VK₁和VK₃具有促进成骨细胞和抑制破骨细胞的作用，可能原因是选择的筛选浓度过低所致。MK₄和MK₇在1 μmol/L能促进成骨细胞增殖和矿化作用，二者并没有显著差异。但在抑制骨吸收作用方面，MK₄相较于MK₇在相同浓度，有更显著的抑制TRAP活性的作用。

CTSK是破骨细胞发挥骨吸收作用的关键靶标酶，选择性地大量表达于破骨细胞，其生理作用底物正是在有机骨基质中含量达95%的I型胶原^[11]。我们研究发现，在相同浓度，只有MK₄能显著抑制其底物骨胶原降解和人工合成底物Z-FR-MCA的活性。

日本早在1995年首次将MK₄作为治疗骨质疏松的药物应用^[15]，2011年MK₄录入我国《原发性骨质疏松症诊疗指南》^[16]。因此，我们认为MK₄是人体内源性营养物质，安全性高，适用于各年龄人群作为营养补充剂使用。MK₇具有促进骨形成作用，在体内也可以分解成MK₄发挥作用，适合作为营养食品补充剂。