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用LC-MS法测定人血浆中顺式阿曲库铵的浓度

辛博 万丽丽 王婧 刘金变 霍炎 郭澄

辛博, 万丽丽, 王婧, 刘金变, 霍炎, 郭澄. 用LC-MS法测定人血浆中顺式阿曲库铵的浓度[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(2): 148-151. doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.201909001
引用本文: 辛博, 万丽丽, 王婧, 刘金变, 霍炎, 郭澄. 用LC-MS法测定人血浆中顺式阿曲库铵的浓度[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(2): 148-151. doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.201909001
XIN Bo, WAN Lili, WANG Jing, LIU Jinbian, HUO Yan, GUO Cheng. Cisatracurium assay in human plasma by LC-MS[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(2): 148-151. doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.201909001
Citation: XIN Bo, WAN Lili, WANG Jing, LIU Jinbian, HUO Yan, GUO Cheng. Cisatracurium assay in human plasma by LC-MS[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(2): 148-151. doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.201909001

用LC-MS法测定人血浆中顺式阿曲库铵的浓度

doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.201909001
基金项目: 上海市科委科研计划项目(16DZ191110A);上海市科委科研计划项目(16DZ1911109)
详细信息
    作者简介:

    辛 博,博士,药士,研究方向:临床药学,Email:jiayouxinbo@126.com

    通讯作者: 郭 澄,博士,教授,博士生导师,研究方向:临床药学,Email:guopharm@126.com
  • 中图分类号: R284.1

Cisatracurium assay in human plasma by LC-MS

图(2) / 表(6)
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-09-01
  • 修回日期:  2020-01-09
  • 网络出版日期:  2020-04-23
  • 刊出日期:  2020-03-01

用LC-MS法测定人血浆中顺式阿曲库铵的浓度

doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.201909001
    基金项目:  上海市科委科研计划项目(16DZ191110A);上海市科委科研计划项目(16DZ1911109)
    作者简介:

    辛 博,博士,药士,研究方向:临床药学,Email:jiayouxinbo@126.com

    通讯作者: 郭 澄,博士,教授,博士生导师,研究方向:临床药学,Email:guopharm@126.com
  • 中图分类号: R284.1

摘要:   目的  建立高效液相色谱串联质谱方法( LC-MS )测定人血浆中顺式阿曲库铵的浓度,并应用于临床治疗药物监测。  方法  采用盐酸普罗帕酮同位素内标,样品经2%甲酸水和含内标的乙腈溶液沉淀蛋白处理。HPLC色谱柱为Agilent SB-C18,柱温35 ℃,流速0.3 ml/min,流动相为0.1%甲酸水和0.1%甲酸乙腈溶液,梯度洗脱。质谱检测方式为ESI正离子模式,MRM扫描,监测阿曲库铵m/z 464.6~358.4,盐酸普罗帕酮(内标)m/z 342.2~116.2。  结果  人血浆中顺式阿曲库铵在该条件下分离良好,在2~500 ng/ml浓度范围内线性关系良好(r=0.996 5),定量下限为2 ng/ml。方法日内精密度RSD<16.0%;日间精密度RSD<6.0%。平均回收率为97.63%~111.93%;血浆样品室温放置4 h,-80 ℃放置14 d,处理后室温放置24 h,稳定性良好。  结论  本方法简便、准确、快速、稳定,适用于顺式阿曲库铵的血药浓度测定。

English Abstract

辛博, 万丽丽, 王婧, 刘金变, 霍炎, 郭澄. 用LC-MS法测定人血浆中顺式阿曲库铵的浓度[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(2): 148-151. doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.201909001
引用本文: 辛博, 万丽丽, 王婧, 刘金变, 霍炎, 郭澄. 用LC-MS法测定人血浆中顺式阿曲库铵的浓度[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(2): 148-151. doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.201909001
XIN Bo, WAN Lili, WANG Jing, LIU Jinbian, HUO Yan, GUO Cheng. Cisatracurium assay in human plasma by LC-MS[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(2): 148-151. doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.201909001
Citation: XIN Bo, WAN Lili, WANG Jing, LIU Jinbian, HUO Yan, GUO Cheng. Cisatracurium assay in human plasma by LC-MS[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(2): 148-151. doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.201909001
  • 顺式阿曲库铵(cisatracurium, CA)是一种新型中时效非去极化肌松药,其结构式如图1,因其代谢方式(Hofmann elimination,霍夫曼降解)独特,同时释放较低水平的组胺,在临床麻醉过程中被广泛应用。因与其他非去极化肌松药一样,存在术后肌松残留作用[1],且已成为麻醉后呼吸系统不良事件的主要原因。因此,为保证患者围术期安全,对顺式阿曲库铵进行血药浓度监测十分必要。

    图  1  顺式阿曲库铵的结构式

    CA的稳定性主要受温度和pH影响,温度和pH升高可加快其消除,因此离体后的生物样本稳定性是血药浓度监测方法建立的一个难点。国内外文献报道测定人血浆中CA浓度的方法主要为高效液相色谱荧光检测法(HPLC-FD)及高效液相色谱串联质谱法(LC-MS)[2-6],但样本前处理方法较为复杂。本研究在既往文献报道的基础上,建立了一种更加简便、准确、快速、稳定的LC-MS方法,适用于人血浆中CA的血药浓度测定。

    • 高效液相色谱仪(Agilent 6410,美国Agilent公司);Triple Quad三重四极杆质谱仪,配电喷雾(ESI)离子源(美国Agilent公司);纯水机(Millipore);分析天平(BP211D,德国Sartorius公司)。对照品顺式阿曲库铵(cisatracurium,CA,批号:C496700,纯度90%,Toronto Reasearch Chemicals Inc公司);对照品盐酸普罗帕酮(propafenone hydrochloride,PPF,批号:101190-201101,纯度99.9%,中国药品食品检定研究院);乙腈、甲酸均为质谱纯(美国TEDIA公司);水为自制超纯水。

    • Agilent SB-C18色谱柱(2.1 mm×50 mm, 3 µm),柱温35 ℃;流动相A为0.1%甲酸水溶液,B为0.1%甲酸乙腈溶液。线性梯度洗脱:0 ~1 min, 20% B;1~3 min,50% B;3 ~5 min,20% B; 5 ~10 min,20% B。流速0.3 ml/min;进样量2 µl。

    • 采用正离子工作模式;离子源为ESI源;多反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)。毛细管电压4 000 V;干燥器温度350 ℃;干燥气流速12 L/min;雾化器压力35 psi。MRM监测离子对,离子驻留时间、碰撞诱导解离电压及碰撞能量等参数见表1。典型质谱图见图2

      表 1  质谱条件

      成分母离子子离子驻留时间(t/ms)碰撞电压(U/V)电子倍增电压( U/V)碰撞能量(U/V)
      CA464.4358.4 2011020020
      PPF342.2166.220013020017

      图  2  HPLC-MS色谱图

    • CA标准储备液:精密称取CA 10 mg置10 ml容量瓶,加入2%甲酸甲醇溶液至刻度,溶解混匀,配制成相当于CA质量浓度为1 mg/ml的储备液,于冰箱(4 ℃)备用。

      CA标准工作液:精密吸取CA储备液适量,用50%甲醇水溶液配制成系列浓度的工作溶液,其中,CA质量浓度分别为5 000、2 500、1 000、500、250、100、20 ng/ml。

      PPF标准储备液:精密称取PPF 0.4 mg置2 ml容量瓶,加甲醇至刻度,溶解混匀,配制成相当于PPF质量浓度为0.2 mg/ml的储备液,于冰箱(4 ℃)备用。

      PPF标准工作液:精密吸取PPF储备液适量,配制成200 ng/ml的含内标乙腈溶液。

    • 精密吸取血浆30 μl,加入2%甲酸水溶液30 μl,振摇10 s,再加50 μl含内标乙腈溶液后旋涡振荡10 s,12 000 r/ min离心10 min,转移上清液置进样瓶,进样。

    • 取空白人血浆,精密加入不同浓度的对照品溶液,配制成CA浓度为500、250、100、50、25、10、2 ng/ml的血浆标准品。以浓度为X轴,样品峰与内标峰的比值为Y轴,进行线性回归,经“1/X”权重得回归方程分别为:Y = 7.43×10–3 + 1.99 × 10–2X (r = 0.996 5)。结果表明,CA在2~500 ng/ml内,线性关系良好。本方法CA的定量下限为2 ng/ml。

    • 配制CA浓度分别为8、80、400 ng/ml的血浆样品,日内误差以3个浓度各5个样品的测定结果表示;日间误差以3个浓度样品分别3个批次结果表示。人空白血浆分别加入不同浓度CA工作溶液,按照“2.3”项下方法提取后,相同色谱条件进行浓度测定。同时测定用流动相稀释为相应浓度的无基质溶液的峰面积,以计算绝对回收率。结果如表2所示。

      表 2  CA人血浆样品的系统精密度与准确度(回收率)

      CA理论浓度(ng/ml)日内日间
      测得浓度(ng/ml)精密度RSD(%)准确度REC(%)测得浓度(ng/ml)精密度RSD(%)准确度REC(%)
      8 8.532.39106.67 8.522.00106.46
      80 89.541.77111.93 88.163.48110.19
      400390.5315.9 97.63398.595.19 99.65
    • 空白血浆分别配制成8、80、400 ng/ml的样品,每批次各3个,分别考察其①室温下放置4 h;②处理后室温放置24 h;③-80 ℃放置14 d的稳定性。结果如表3所示。

      表 3  CA人血浆样品不同条件下的稳定性

      时间样品浓度(ng/ml)REC(%)RSD(%)
      室温4 h103.50 9.28
      98.27 5.26
      101.33 3.73
      处理后室温24 h 77.22 5.37
      112.9510.83
      110.46 6.80
      –80 ℃ 14 d 75.40 7.95
      113.6723.61
      98.22 1.69
    • 取6个不同来源的人空白血浆30 μl,除不加内标外,其余按“2.3”项下操作,取上清液,分别制备成CA浓度为31.25和1 000 ng/ml;PPF浓度为200 ng/ml的溶液,进样测定,记录峰面积。另用流动相将CA稀释成31.25和1 000 ng/ml;PPF浓度为200 ng/ml浓度的溶液,进样测定,记录峰面积。

      基质效应=(空白基质中添加工作溶液峰面积/重组溶液中添加工作溶液峰面积)×100%

      CA的基质效应为52%(RSD 2.09%~15.33%)。PPF的基质效应为96.71%(RSD4.6%)。

    • 采用肌松仪监测患者注射苯磺顺式阿曲库铵后神经肌肉阻滞程度。给予4个成串刺激(train of four stimulation,TOF),给药后,T4最先发生衰减,T1最后衰减。当T1消失即仪器显示为0时,肌肉阻滞程度最大,随后逐渐恢复。分别在T0(T1消失至0)、TOFr 50(恢复至50%)、TOFr 90(恢复至90%)时采集输液对侧动脉血3 ml,并及时保存于4 ℃冰箱中。采用建立的方法测定样本血药浓度,结果见表4。同时记录T0(给药结束到T1消失至0)、TOFr50(给药结束到恢复至50%)、TOFr90(给药结束到恢复至90%)发生所需时间,结果见表5表6

      表 4  6例受试者血浆中CA血药浓度测定结果

      TOF (%)浓度(ng/ml)
      受试者1受试者2受试者3受试者4受试者5受试者6
      0445.02525.30253.83165.29150.57309.22
      50 76.58125.65 68.71 68.99 53.18 58.46
      90 44.10 71.80 60.72 71.74 41.12 45.07

      表 5  6例受试者临床资料

      基本信息受试者1受试者2受试者3受试者4受试者5受试者6
      性别
      年龄(岁) 50 49 53 70 36 40
      体重(m/kg) 70 75 60 50 53 80
      身高(l/cm)165165164161165173

      表 6  6例受试者达到各TOF值的时间

      TOF(%)时间(t/min)
      0 101515 2020 20
      50 707065 6565 75
      90105959510085110
    • CA的代谢途径主要为Hoffman消除[7],Hoffman消除受温度和pH值的影响。有研究显示[8],将苯磺顺阿曲库铵注射液稀释于20%的甲醇中,室温下,10~15 min即可检测到大量降解产物N-甲基四氢罂粟碱和单季丙烯酸酯。血浆的pH值在7.4左右。我们发现,在CA血浆样本前处理过程中,如果不加入酸调节pH值,即使在-80 ℃的储存条件下,CA仍然会很快降解(结果未在文中体现)。为此,我们考察了不同比例的甲酸,最终确定了在样本前处理过程中加入2%的甲酸能够保证血浆中CA的稳定性。在既往报道中,多是加入一定浓度的硫酸来调控pH值[2-6]。硫酸为有机酸,对测定仪器尤其是质谱仪的离子源损害很大。同时,加入硫酸并不能保证室温条件下样本的长时间稳定(<4 h)[9]。本研究结果显示,加入2%的甲酸,室温下样本稳定性可保持在24 h以上。此外,我们的样本前处理过程并不需要经过离心-上清液真空浓缩或氮吹浓缩-复溶-离心取上清液等[2-6, 9]复杂过程,更为省时、省力。经验证,本研究建立的方法测定CA血浆样本的精密度、准确度和稳定性均符合方法学要求。该方法更加简便、准确、快速、稳定,可应用于临床CA治疗药物浓度的监测。

参考文献 (9)

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