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二至丸中抑制组织蛋白酶K活性的物质基础研究

蒋益萍 金玉娥 张志玮 夏天爽 徐佳乐 冯坤苗 薛黎明

蒋益萍, 金玉娥, 张志玮, 夏天爽, 徐佳乐, 冯坤苗, 薛黎明. 二至丸中抑制组织蛋白酶K活性的物质基础研究[J]. 药学实践与服务. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202202008
引用本文: 蒋益萍, 金玉娥, 张志玮, 夏天爽, 徐佳乐, 冯坤苗, 薛黎明. 二至丸中抑制组织蛋白酶K活性的物质基础研究[J]. 药学实践与服务. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202202008
Jiang Yi Ping, Jin Yu E, Zhang Zhi Wei, Xia Tian Shuang, Xu Jia Le, Feng Kun Miao, Xue Li Ming. Study on material basis of cathepsin K targeted inhibitor in Erzhi Wan[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202202008
Citation: Jiang Yi Ping, Jin Yu E, Zhang Zhi Wei, Xia Tian Shuang, Xu Jia Le, Feng Kun Miao, Xue Li Ming. Study on material basis of cathepsin K targeted inhibitor in Erzhi Wan[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202202008

二至丸中抑制组织蛋白酶K活性的物质基础研究

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202202008
基金项目: 上海市卫生健康委员会中医药重点项目(2020YZ001),上海市‘医苑新星’青年医学人才培养资助计划(沪卫人事〔2021〕99号)
详细信息
    作者简介:

    蒋益萍,实验师,研究方向:中药药效物质基础和中药药理研究, Email:msjyz@163.com

    通讯作者: 薛黎明,副主任技师,研究方向:中药药理、组织蛋白酶K与骨疾病研究,Email:xueliming@scdc.sh.cn

Study on material basis of cathepsin K targeted inhibitor in Erzhi Wan

  • 摘要:   目的  考察传统补肾经典名方二至丸中抑制组织蛋白酶K的活性部位和活性成分。  方法  采用高通量荧光方法筛选二至丸中正丁醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和石油醚提取部位,以及二至丸主要活性成分对组织蛋白酶K(CTSK)与荧光合成底物Z-FR-MCA结合活性的抑制率,和对CTSK与硫酸软骨素A(CSA)复合物形成活性抑制率。进而考察二至丸不同提取部位和活性成分抑制CTSK生理底物I型胶原蛋白降解活性,并采用分子对接和底物结合实验验证潜在CTSK抑制剂。  结果  二至丸的正丁醇和石油醚提取部位对CTSK与CSA复合物形成抑制率超过90%,石油醚提取部位对CTSK与底物Z-FR-MCA结合抑制率超过90%,正丁醇提取部位对CTSK的胶原降解抑制率超过95%、石油醚提取部位为58.6%。30个有效成分中11个显示对CTSK与CSA复合物形成抑制率超过50%,有5个成分对CTSK与荧光底物Z-FR-MCA结合活性抑制率超过50%。最终筛选确定4个成分墨旱莲皂苷Ⅸ、表儿茶素没食子酸酯、女贞苷和蟛蜞菊内酯,对胶原降解抑制率超过50%,其中墨旱莲皂苷Ⅸ抑制胶原纤维与CTSK的结合率最高达60%,但均与CTSK活性位点分子对接不成功。  结论  二至丸中存在抑制组织蛋白酶K的活性物质,主要存在于正丁醇部位,但活性成分不是活性位点抑制剂,可能通过与其他位点结合,间接抑制CTSK与寡多糖结合,进而降低了CTSK的胶原降解活性。
  • 图  1  DMSO浓度对CTSK抑制剂筛查方法的影响

    A. Z-FR-MCA活性;B.CTSK/CSA*复合物;C.胶原降解活性与不加DMSO组比较,*P<0.05, ***P<0.001。

    图  2  二至丸的不同部位提取物抑制CTSK活性作用

    A.Z-FR-MCA抑制率; B.CTSK/CSA*抑制率;C.SDS-PAGE胶原图;D.胶原降解抑制率

    图  3  4种潜在活性化合物抑制CTSK和胶原结合作用

    A.剩余CTSK的百分含量;B.胶原与CTSK结合抑制率与不加抑制剂组比较, ***P<0.001。

    表  1  二至丸中化学成分抑制组织蛋白酶K活性筛选

    化合物成分英文名称CTSK/CSA*
    抑制率(%)
    ZFR-MCA
    抑制率(%)
    Libdock
    得分
    胶原降解
    抑制率(%)
    来源
    墨旱莲皂苷Ⅴeclalbasaponin Ⅴ00/M
    墨旱莲皂苷Ⅰeclalbasaponin Ⅰ00/M
    墨旱莲皂苷Ⅱeclalbasaponin Ⅱ00/M
    墨旱莲皂苷Ⅶeclalbasaponin Ⅶ11.3±1.30/M
    墨旱莲皂苷ⅨeclalbasaponinⅨ88.6±9.20/70.3M
    红景天苷Salidroside27.8±3.10/N
    异毛蕊花糖苷Isoacteoside65.3±4.70//N
    橄榄苦苷Oleuroprin35.9±2.40/N
    蟛蜞菊内酯Wedelolactone58.7±5.82.81/50.1M
    熊果酸Ursolic Acid059.7/N
    齐暾果酸Oleanic acid047.1/N
    刺囊酸Echinocystic acid00/M
    木樨草素Luteolin62.1±8.60/M、N
    蒙花苷linarin37.2±3.10/M
    槲皮素quercitrin68.5±5.90/M、N
    木樨草苷galuteolin33.2±3.70/M、N
    异去甲基蟛蜞菊内酯Isowedelolactone07.0/M
    松果菊苷Echinacoside55.9±6.59.7/N
    女贞苷Nuezhenoside51.2±4.70.10/53.2N
    特女贞苷Specneuzhenide58.6±6.417.9/49.7N
    女贞苷G13Nuezhenoside G1323.7±2.40.16/N
    3-O-乙酰基齐墩果酸3-O-acetyl oleanolic acid066.7/N
    19α-羟基熊果酸19α-OH Ursolic Acid053.2/N
    儿茶素catechin11.315.3/M
    表儿茶素L-Epicatechin12.718.7/M
    表儿茶素没食子酸酯(-)-Epicatechin gallate51.2±5.410.5/60.2M
    大黄素甲醚Emodin monomethyl ether19.8±1.70/N
    β-谷甾醇β- Sitosterol00/N
    3’ 4-二羟基苯乙醇3,4-dihydroxyphenethyl70.3±8.483.276.4848N
    对羟基苯乙醇p-hydroxyphenethyl62.4±6.779.573.9225N
    注:M:墨旱莲;N:女贞子。
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2022-02-09
  • 修回日期:  2022-11-05

二至丸中抑制组织蛋白酶K活性的物质基础研究

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202202008
    基金项目:  上海市卫生健康委员会中医药重点项目(2020YZ001),上海市‘医苑新星’青年医学人才培养资助计划(沪卫人事〔2021〕99号)
    作者简介:

    蒋益萍,实验师,研究方向:中药药效物质基础和中药药理研究, Email:msjyz@163.com

    通讯作者: 薛黎明,副主任技师,研究方向:中药药理、组织蛋白酶K与骨疾病研究,Email:xueliming@scdc.sh.cn

摘要:   目的  考察传统补肾经典名方二至丸中抑制组织蛋白酶K的活性部位和活性成分。  方法  采用高通量荧光方法筛选二至丸中正丁醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和石油醚提取部位,以及二至丸主要活性成分对组织蛋白酶K(CTSK)与荧光合成底物Z-FR-MCA结合活性的抑制率,和对CTSK与硫酸软骨素A(CSA)复合物形成活性抑制率。进而考察二至丸不同提取部位和活性成分抑制CTSK生理底物I型胶原蛋白降解活性,并采用分子对接和底物结合实验验证潜在CTSK抑制剂。  结果  二至丸的正丁醇和石油醚提取部位对CTSK与CSA复合物形成抑制率超过90%,石油醚提取部位对CTSK与底物Z-FR-MCA结合抑制率超过90%,正丁醇提取部位对CTSK的胶原降解抑制率超过95%、石油醚提取部位为58.6%。30个有效成分中11个显示对CTSK与CSA复合物形成抑制率超过50%,有5个成分对CTSK与荧光底物Z-FR-MCA结合活性抑制率超过50%。最终筛选确定4个成分墨旱莲皂苷Ⅸ、表儿茶素没食子酸酯、女贞苷和蟛蜞菊内酯,对胶原降解抑制率超过50%,其中墨旱莲皂苷Ⅸ抑制胶原纤维与CTSK的结合率最高达60%,但均与CTSK活性位点分子对接不成功。  结论  二至丸中存在抑制组织蛋白酶K的活性物质,主要存在于正丁醇部位,但活性成分不是活性位点抑制剂,可能通过与其他位点结合,间接抑制CTSK与寡多糖结合,进而降低了CTSK的胶原降解活性。

English Abstract

蒋益萍, 金玉娥, 张志玮, 夏天爽, 徐佳乐, 冯坤苗, 薛黎明. 二至丸中抑制组织蛋白酶K活性的物质基础研究[J]. 药学实践与服务. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202202008
引用本文: 蒋益萍, 金玉娥, 张志玮, 夏天爽, 徐佳乐, 冯坤苗, 薛黎明. 二至丸中抑制组织蛋白酶K活性的物质基础研究[J]. 药学实践与服务. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202202008
Jiang Yi Ping, Jin Yu E, Zhang Zhi Wei, Xia Tian Shuang, Xu Jia Le, Feng Kun Miao, Xue Li Ming. Study on material basis of cathepsin K targeted inhibitor in Erzhi Wan[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202202008
Citation: Jiang Yi Ping, Jin Yu E, Zhang Zhi Wei, Xia Tian Shuang, Xu Jia Le, Feng Kun Miao, Xue Li Ming. Study on material basis of cathepsin K targeted inhibitor in Erzhi Wan[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202202008
  • 组织蛋白酶K(CTSK) 属于半胱氨酸蛋白酶,是细胞内重要的溶酶体酶,在很多组织中有表达,如肺、脑、皮肤,骨骼和甲状腺等。CTSK在体内主要发挥降解骨胶原蛋白、弹性纤维蛋白、甲状腺球蛋白及细胞外基质的作用,与人类多种疾病密切相关,如肿瘤[1]、骨疾病、心血管疾病和肺纤维化等[2]。CTSK最早发现在破骨细胞特异性高表达,主要发挥降解骨基质中含量达95%的Ⅰ型胶原[2]。基于生物化学和结构分析研究发现CTSK与黏多糖(GAGs)可形成一种复合物,如硫酸软骨素(chondroitin-4-sulfate, C4S或CSA),且只有这种复合物形成下才能更好发挥降解胶原作用[3]

    二至丸是治疗肾阴虚症的经典名方,由女贞子和墨旱莲组成,经考证出自明代吴曼辑所著的《扶寿精方》,收载于2020版《中国药典》,具补益肝肾,滋阴止血功效[4]。药理研究发现二至丸具有保肝降酶、增强免疫调节、改善血液系统功能、抗肿瘤、抗骨质疏松、抗衰老、抗氧化、抗变态反应性炎症和植物雌激素样等作用[5]。临床报道,二至丸常用于治疗骨质疏松[6-8],药理发现二至丸显著降低去卵巢骨质疏松大鼠血清中CTSK水平[5]。我们前期研究发现墨旱莲的正丁醇提取部位和活性成分墨旱莲皂苷IX能显著抑制CTSK的胶原降解活性[9]。因此,二至丸很有可能存在抑制组织蛋白酶K的活性成分,从中筛选组织蛋白酶K抑制剂具有可能。本研究采用荧光偏振法考察CTSK与硫酸软骨素A(CSA)复合物形成活性,荧光光度法考察CTSK与合成荧光底物benzyloxycarbonyl-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin (Z-FR-MCA)结合活性,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳法考察CTSK降解生理底物胶原蛋白和明胶的活性,以期从二至丸不同提取部位和活性成分中筛查具有抑制CTSK活性的抑制剂,最终阐明二至丸抑制CTSK酶活性的物质基础。

    • 墨旱莲、酒女贞子药材购自上海华宇药业有限公司, 经海军军医大学生药学教研室韩婷教授鉴定墨旱莲为菊科植物鳢肠 Ecliptaprostrata L. 的干燥地上部分,女贞子为木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果实。其活性成分异毛蕊花糖苷、橄榄苦苷、蟛蜞菊内酯、熊果酸、齐暾果酸、蒙花苷、槲皮苷、木樨草苷、异去甲基蟛蜞菊内酯、松果菊苷、特女贞苷、红景天甙、女贞苷、女贞苷G13等24种标准品均购自成都瑞芬思生物科技有限公司。

      Benzyloxycarbonyl-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin (Z-FR-MCA)购自日本WAKO公司;E-64 (L-3-carboxy-trans-2-3-epoxypropionyl-leucylamido-(4guanidino)-butane)和硫酸软骨素A (CSA)购自美国Sigma公司;荧光标记硫酸软骨素A(CSA*)购自日本株式会社Cosmo Bio公司;人I型胶原蛋白(Human collagen I)购自美国Affymetrix公司,牛不溶性I型胶原蛋白(Bovine type I insoluble collagen) 购自生工生物工程(上海)公司。

    • 墨旱莲500 g,加入10倍量水(W/V),煎煮2次,每次1 h,合并提取液,煎煮浓缩,冷冻干燥,粉碎得墨旱莲水提取物。酒女贞子按照2020版药典二至丸制备方法,粉碎过80目筛。将酒女贞子粉末500 g与墨旱莲水提取物粉末混匀,用10倍量正丁醇(w/v)回流提取2次,每次1h,过滤,合并滤液,旋转蒸发浓缩后,冷冻干燥得正丁醇部位提取物。滤渣挥干,按照正丁醇方法依次分别用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯溶液对滤渣进行萃取,冷冻干燥得到二至丸的正丁醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯提取物。

      研究报道二至丸的活性成分,主要包括墨旱莲三萜皂苷类和女贞子环烯醚萜苷类成分,及一些黄酮类、苯乙醇苷类等成分[10-12]。本研究30个成分由墨旱莲皂苷 (Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ) 和刺囊酸是由墨旱莲正丁醇部位经凝胶柱层析分离得到[9],墨旱莲中蟛蜞菊内酯、异去甲基蟛蜞菊内酯、木樨草素、槲皮苷、木樨草苷,和女贞子中异毛蕊花糖苷、橄榄苦苷、熊果酸、齐暾果酸、木樨草素、槲皮苷、木樨草苷、松果菊苷、特女贞苷、红景天甙、女贞苷、女贞苷G13、3-O-乙酰基齐墩果酸、19α-羟基熊果酸、大黄素甲醚、β-谷甾醇、3’4-二羟基苯乙醇、对羟基苯乙醇等成分为购买标准品。

    • 二至丸不同提取部位和化合物用DMSO溶解分别配置40 mg/ml和10 mmol/L的储备溶液,并在分析之前用100 mmol/L醋酸钠缓冲液(pH5.5,包含2.5 mmol/L DTT和2.5 mmol/L EDTA) 分别稀释至浓度为25 µg/mL和 25 µmol/ml (DMSO低于1%),加入黑色荧光96孔板,最终反应容量为0.2 ml。加入终浓度为5 nmol/L的CTSK孵育5 min,加入Z-FR-MCA底物(终浓度1 mmol/L),孵育30 s,实时检测5 min荧光生成斜率(slope)值(发散光波长460 nm,吸收光波长355 nm)。所有测量均使用荧光仪Tecan spark(美国)在96孔板中进行,单孔体积为200 µl。实验设阴性对照组(无抑制剂),阳性对照组(E-64,活性位点抑制剂)。计算公式:抑制率%= 100−(1−Vi /V0)。Vi和V0分别表示存在和不存在抑制剂情况下的荧光信号。

    • 将100 µg/mL不同部位或25 µM/mL有效成分与200 nmol的CTSK在含有2.5 mmol/L DTT和EDTA的100 mmol/L醋酸钠缓冲液(pH 5.5)中,混匀放置5min,然后添加20 nmol/L CSA*,混匀放置15min,室温下实时检测5min荧光生成斜率(slope)值(发散光波长485 nm,吸收光波长520 nm),所有测量均使用荧光仪Tecan spark(美国)在黑色荧光96孔板中进行,总体积为100 µl。设置不使用抑制剂(阴性对照)和300 mmol/L NaCl(阳性对照)。CTSK和FP之间的关系使用抑制百分比进行分析,计算公式:%抑制率=100− [(100×(FPCTSK/抑制剂/CSA*−FP CSA*)/(FPCTSK/CSA*−FP CSA*)]其中,FPCTSK/抑制剂/CSA*和FPCTSK/CSA*分别是在存在和不存在抑制剂的情况下测定荧光信号。

    • 人I型胶原0.6 mg/mL溶解于100 mmol/L醋酸钠缓冲液(pH5.5,包含2.5 mmol/L DTT和2.5 mmol/L EDTA)中,依次加入CTSK (最终浓度400 nmol/L)、CSA (最终浓度200 nmol/L) 和400 μg/mL二至丸不同提取部位或不同浓度潜在抑制剂(100、80、60、40、20、10 μmol/L),加入到含有I型胶原蛋白的缓冲液,单孔体积50 μL,混匀,28 ℃孵育4 h。取出后加入1μL的 100 μmol/L E64终止反应。采用10%的SDS-PAGE凝胶电泳分离,考马斯亮蓝染色20 min,用乙酸-甲醇(4∶1)脱色。I型胶原的α1条带的灰度用ImageJ2软件进行定量分析。

    • 称取1 mg不溶性牛I型胶原蛋白置于1.5毫升EP管中,加入1 umol/L CTSK酶和25 μmol/L潜在抑制剂于40uL缓冲液中(100 mmol/L醋酸盐缓冲液,pH值5.5,含有2.5 mmol/L DTT和2.5 mmol/L EDTA)。采用Z-FR-MCA底物结合活性方法在T0 min测定CTSK活性,在37 ℃下孵育30分钟后,检测T30 min时的CTSK活性。从中取出40 μl上清液,添加2.0μl NaCl(最终300 mmol/L),然后再次检查CTSK活性,记录为T30salt min。计算公式:结合率(%)

    • 用Discovery studio 2016软件中的libdock分子对接方法考察活性成分和组织蛋白酶K(1ATK) 蛋白进行刚性对接。利用LibDock得分作为表征化合物与活性位点结合的核心指标。LibDock得分分数越高,小分子与受体结合的活性越高。

    • 每组实验重复3次。采用SPSS软件经ANOVA方差分析检验,差异有统计学意义(α=0.05),再采用Student's t检验进行两组比较,以P<0.05为统计学意义。

    • 本研究考察了DMSO浓度(10%、5%、2%和1%)对CTSK的Z-FR-MCA活性和CTSK/CSA*复合物形成活性高通量筛查方法,及SDS-PAGE胶原降解活性筛选方法的影响。结果发现,10%、5%、2%的DMSO显著抑制CTSK的Z-FR-MCA底物结合(图1A)和CTSK/CSA*复合物形成活性(图1B)。10%的DMSO显著抑制CTSK的胶原降解,1%和2%的DMSO对胶原降解无显明显抑制作用。因此,本研究筛查二至丸的抑制CTSK活性方法将DMSO浓度控制在1%以下。

      图  1  DMSO浓度对CTSK抑制剂筛查方法的影响

    • 对二至丸的不同提取部位(正丁醇、石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷) 进行了抑制CTSK活性筛选,其中Z-FR-MCA底物结合实验结果显示,二至丸的石油醚部位抑制作用明显,为96.3%,正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷提取部位抑制率分别为26.1%、50.8%和43.5%(见图2A)。二至丸正丁醇、石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷提取部位提取物对CTSK/CSA*复合物形成的抑制效率分别为99.6%、52.0%、94.8%和59.8%,胶原降解活性结果显示二至丸的正丁醇部位抑制作用最明显,达到100%,石油醚提取部位达58%,二氯甲烷和乙酸乙酯提取部位效果也不明显,分别为33.1%和6.7%(图2C-2D)。

      图  2  二至丸的不同部位提取物抑制CTSK活性作用

    • 本研究对30种二至丸中的活性成分进行了体外筛选,结果发现25 uM的墨旱莲皂苷Ⅸ、异毛蕊花糖苷、蟛蜞菊内酯、木樨草素、槲皮素、松果菊苷、女贞苷、特女贞苷、3,4-二羟基苯乙醇和对羟基苯乙醇抑制CTSK/CSA*复合物形成的抑制率超过50%,表儿茶素没食子酸酯为51.2%。而在25uM时,仅有齐墩果酸、3-0-乙酰基齐墩果酸、19α-羟基熊果酸、3,4-二羟基苯乙醇、对羟基苯乙醇对CTSK与Z-FR-MCA结合活性超过50%的抑制效率,熊果酸维47.1%抑制率。采用libdock技术发现仅有3,4-二羟基苯乙醇和对羟基苯乙醇与CTSK活性位点对接有得分。因此,这些超过50%抑制率的二至丸活性成分被认为具有潜在抑制胶原降解活性。 针对以上12种活性成分,进行胶原降解抑制实验,结果显示在100uM时,墨旱莲皂苷Ⅸ,对胶原降解抑制率达70.3%,女贞苷53.2%,蟛蜞菊内酯达50.1%和表儿茶素没食子酸酯为60.2%。异毛蕊花糖苷、木樨草素、槲皮素、松果菊苷、特女贞苷、熊果酸、齐墩果酸、3-O-乙酰基齐墩果酸、19α-羟基熊果酸、3,4-二羟基苯乙醇、对羟基苯乙醇均显示无抑制胶原降解活性(表1)。

      表 1  二至丸中化学成分抑制组织蛋白酶K活性筛选

      化合物成分英文名称CTSK/CSA*
      抑制率(%)
      ZFR-MCA
      抑制率(%)
      Libdock
      得分
      胶原降解
      抑制率(%)
      来源
      墨旱莲皂苷Ⅴeclalbasaponin Ⅴ00/M
      墨旱莲皂苷Ⅰeclalbasaponin Ⅰ00/M
      墨旱莲皂苷Ⅱeclalbasaponin Ⅱ00/M
      墨旱莲皂苷Ⅶeclalbasaponin Ⅶ11.3±1.30/M
      墨旱莲皂苷ⅨeclalbasaponinⅨ88.6±9.20/70.3M
      红景天苷Salidroside27.8±3.10/N
      异毛蕊花糖苷Isoacteoside65.3±4.70//N
      橄榄苦苷Oleuroprin35.9±2.40/N
      蟛蜞菊内酯Wedelolactone58.7±5.82.81/50.1M
      熊果酸Ursolic Acid059.7/N
      齐暾果酸Oleanic acid047.1/N
      刺囊酸Echinocystic acid00/M
      木樨草素Luteolin62.1±8.60/M、N
      蒙花苷linarin37.2±3.10/M
      槲皮素quercitrin68.5±5.90/M、N
      木樨草苷galuteolin33.2±3.70/M、N
      异去甲基蟛蜞菊内酯Isowedelolactone07.0/M
      松果菊苷Echinacoside55.9±6.59.7/N
      女贞苷Nuezhenoside51.2±4.70.10/53.2N
      特女贞苷Specneuzhenide58.6±6.417.9/49.7N
      女贞苷G13Nuezhenoside G1323.7±2.40.16/N
      3-O-乙酰基齐墩果酸3-O-acetyl oleanolic acid066.7/N
      19α-羟基熊果酸19α-OH Ursolic Acid053.2/N
      儿茶素catechin11.315.3/M
      表儿茶素L-Epicatechin12.718.7/M
      表儿茶素没食子酸酯(-)-Epicatechin gallate51.2±5.410.5/60.2M
      大黄素甲醚Emodin monomethyl ether19.8±1.70/N
      β-谷甾醇β- Sitosterol00/N
      3’ 4-二羟基苯乙醇3,4-dihydroxyphenethyl70.3±8.483.276.4848N
      对羟基苯乙醇p-hydroxyphenethyl62.4±6.779.573.9225N
      注:M:墨旱莲;N:女贞子。
    • 不溶性胶原、抑制剂和CTSK共培养15min,通过检测培养液中剩余CTSK的Z-FR-MCA活性,来验证潜在CTSK抑制剂在体外抑制与CTSK的结合实验,结果显示100uM的墨旱莲皂苷IX(ES-IX)、表儿茶素没食子酸酯(EGCG)、女贞苷(NZS)和蟛蜞菊内酯(WED)抑制率分别达54.8%、64.1%、36.4%和51.4% (图3)。

      图  3  4种潜在活性化合物抑制CTSK和胶原结合作用

    • CTSK抑制剂的高通量筛选方法,多采用合成底物Z-FR-MCA结合活性来筛选,其原理是CTSK可裂解底物端FR-MCA基团, 释放游离的MCA 发色荧光基团, 通过抑制剂引起荧光信号变化差异来检测评价抑制剂活性。基于骨胶原降解需要CTSK与CSA结合发挥作用,采用荧光标记CSA*,形成CTSK/CSA*复合物,其原理为抑制剂与CTSK酶结合形成CTSK/抑制剂/CSA*复合物,导致荧光偏振信号差异,评价抑制剂与CTSK结合活性,可快速、灵敏和准确的判断化合物是否与CTSK存在相互作用。SDS-PAGE凝胶电泳法是常用蛋白质分类技术,将胶原蛋白及其降解产物按照分子量大小迁移,考马斯染色溶液染色,对α1胶原蛋白条带定量,计算胶原蛋白降解率。

      二至丸的正丁醇提取部位抑制CTSK/CSA*复合物形成和胶原降解活性最强,超过95%,但对CTSK的Z-FR-MCA抑制率却仅有26%。Z-FR-MCA作为CTSK活性位点的合成底物,活性成分对Z-FR-MCA抑制率越高,证明对CTSK的活性位点抑制效率越高。基于Bromme教授提出的非活性位点抑制剂的概念[13],活性成分具有显著的抑制胶原降解活性,但对活性位点Z-FR-MCA底物无抑制活性,可称为非活性位点 (exosite) 抑制剂。结果发现,二至丸的正丁醇提取部位可显著抑制胶原降解,而对Z-FR-MCA无显著影响,证明正丁醇提取部位可能存在抑制 CTSK胶原降解活性的活性成分, 而不影响CTSK 活性位点的生理活性。二至丸的正丁醇提取部位的化学成分主要为墨旱莲皂苷类成分和女贞子三萜酸类成分,其中墨旱莲皂苷Ⅸ(ES-Ⅸ)、表儿茶素没食子酸酯(EGCG)、女贞苷(NZS)和蟛蜞菊内酯(WED)可能是潜在的CTSK非活性位点抑制剂。熊果酸和齐墩果酸具有较强的Z-FR-MCA活性,表明可作用CTSK活性位点,而女贞子乙醇提取物、熊果酸、齐墩果酸和墨旱莲的蟛蜞菊内脂均报道显著抑制破骨细胞的骨吸收活性和CTSK的mRNA表达[14, 15],可能通过在细胞内直接作用CTSK酶,使其失去活性。

      CTSK是抗骨质疏松药物研发的关键靶标,中草药,尤其是补肾中药,报道含有丰富的治疗骨质疏松的活性物质,但不清楚这些化合物是否能够抑制CTSK活性,或者特异性抑制胶原酶的活性。除了胶原降解活性,CTSK在甲状腺细胞中发挥降解甲状腺球蛋白,释放甲状腺激素[16],在成纤维细胞中发挥降解纤维蛋白的功能[17]。二至丸中抑制CTSK活性的化合物,可进一步考察对甲状腺球蛋白降解和纤维蛋白降解的作用活性。通过本研究可为中医药中开发CTSK抑制剂提供新的思路。

参考文献 (17)

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