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应中央军委要求,2022年9月起,《药学实践杂志》将更名为《药学实践与服务》,双月刊,正文96页;2023年1月起,拟出版月刊,正文64页,数据库收录情况与原《药学实践杂志》相同。欢迎作者踊跃投稿!

光敏ROS响应型雷帕霉素脂质体的制备及表征

高习清 卢光照 鲁莹 邹豪

高习清, 卢光照, 鲁莹, 邹豪. 光敏ROS响应型雷帕霉素脂质体的制备及表征[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(5): 437-441. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202110051
引用本文: 高习清, 卢光照, 鲁莹, 邹豪. 光敏ROS响应型雷帕霉素脂质体的制备及表征[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(5): 437-441. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202110051
GAO Xiqing, LU Guangzhao, LU Ying, ZOU Hao. Preparation and characterization of photosensitive ROS-responsive rapamycin liposomes[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(5): 437-441. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202110051
Citation: GAO Xiqing, LU Guangzhao, LU Ying, ZOU Hao. Preparation and characterization of photosensitive ROS-responsive rapamycin liposomes[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(5): 437-441. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202110051

光敏ROS响应型雷帕霉素脂质体的制备及表征

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202110051
基金项目: 国家自然基金面上项目( 81773278)
详细信息
    作者简介:

    高习清,硕士研究生,研究方向:光响应制剂研究,Email:gxq1987@163.com

    通讯作者: 邹 豪,博士,副教授,研究方向:纳米靶向递药,Email:ziyuezou@163.com
  • 中图分类号: R943;R96

Preparation and characterization of photosensitive ROS-responsive rapamycin liposomes

图(2) / 表(6)
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  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2021-10-18
  • 修回日期:  2022-02-10
  • 网络出版日期:  2022-09-29
  • 刊出日期:  2022-09-25

光敏ROS响应型雷帕霉素脂质体的制备及表征

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202110051
    基金项目:  国家自然基金面上项目( 81773278)
    作者简介:

    高习清,硕士研究生,研究方向:光响应制剂研究,Email:gxq1987@163.com

    通讯作者: 邹 豪,博士,副教授,研究方向:纳米靶向递药,Email:ziyuezou@163.com
  • 中图分类号: R943;R96

摘要:   目的  研究光敏活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)响应型雷帕霉素脂质体的制备工艺及其性质,旨在开发一种稳定高效的刺激响应型脂质体载体。  方法  采用薄膜分散法制备雷帕霉素脂质体;马尔文激光粒度仪测定其粒径及Zeta电位;利用HPLC法建立雷帕霉素含量测定方法;经近红外光照射后,采用反向透析法考察雷帕霉素脂质体的体外释放特性。  结果  雷帕霉素脂质体粒径<200 nm,PDI值<0.200;雷帕霉素在0.2~40 μg/ml范围与峰面积呈良好的线性关系,相关系数r=0.9995;雷帕霉素脂质体包封率>94.20%;经730 nm近红外光照射5 min后,雷帕霉素脂质体12 h内体外释放率可达60%。  结论  成功制备了光敏ROS响应型雷帕霉素脂质体,具有较高的包封率和体外刺激响应效率。

English Abstract

高习清, 卢光照, 鲁莹, 邹豪. 光敏ROS响应型雷帕霉素脂质体的制备及表征[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(5): 437-441. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202110051
引用本文: 高习清, 卢光照, 鲁莹, 邹豪. 光敏ROS响应型雷帕霉素脂质体的制备及表征[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(5): 437-441. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202110051
GAO Xiqing, LU Guangzhao, LU Ying, ZOU Hao. Preparation and characterization of photosensitive ROS-responsive rapamycin liposomes[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(5): 437-441. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202110051
Citation: GAO Xiqing, LU Guangzhao, LU Ying, ZOU Hao. Preparation and characterization of photosensitive ROS-responsive rapamycin liposomes[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(5): 437-441. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202110051
  • 近红外光响应的肿瘤光热治疗因具有组织穿透性强、生物安全性好等优点,已引起广泛关注。作为新兴的光敏剂,八丁氧基酞菁钯具有成本低、易合成、毒性低等优点,在肿瘤光动力治疗(PDT)领域表现出巨大潜力。由于高渗透强滞留效应(EPR),脂质体作为药物载体可靶向集中于肿瘤组织,同时ROS可氧化破坏脂质双层膜,促进包载药物在肿瘤组织的精准释放。本实验以雷帕霉素为模型药物,采用课题组合成的八丁氧基酞菁钯为光敏剂,制备近红外光触发的ROS响应型雷帕霉素脂质体,并对其理化性质及体外释放特性进行考察。

    • R206D旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司);730 nm/1500 mW激光器(长春市亮丽光电有限公司);U3000高效液相色谱仪(Thermo Fisher公司);JY92.IIDN超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司);马尔文激光粒度仪(英国Malvern公司)。

    • 二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC,Avanti公司);1,2-二亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DLPC,Avanti公司);二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000,Lipoid 公司);胆固醇、雷帕霉素(MCE公司)、八丁氧基酞菁钯[PdPC(OBu)8,实验室自制];磷酸盐缓冲液(PBS,HyClone 公司)。

    • 采用薄膜分散法制备脂质体。精密称取DSPC、DLPC、胆固醇、DSPE-mPEG2000、雷帕霉素、八丁氧基酞菁钯置于250 ml圆底烧瓶中,加入适量氯仿溶解。65 ℃水浴,65 r/min减压旋转蒸发形成均匀薄膜,取PBS溶液4 ml水化。吸出脂质体,用PBS稀释至5 ml,200 W探头超声5 min,即得近红外光触发ROS响应型雷帕霉素脂质体。空白脂质体除不加雷帕霉素、八丁氧基酞菁钯外,制备方法相同。

    • 以脂质体成膜及水化效果、药物包封率及载药量、包载药物光敏释放效率为指标,从DLPC、胆固醇、DSPE-mPEG2000处方量及PdPC(OBu)8投药量对光敏ROS脂质体处方进行单因素考察。

    • 取少量脂质体溶液,用去离子水稀释,使用马尔文激光粒度仪测量脂质体粒径、PDI及Zeta电位。

    • 色谱柱:Agilent TC-C18(2)(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:甲醇-水(84∶16);流速1.0 ml/min;检测波长:278 nm;柱温:50 ℃;进样量:20 μl。

    • 精密称取雷帕霉素2.50 mg置于10 ml容量瓶中,用甲醇定容至刻度,得到浓度为250 μg/ml储备液。精密吸取储备液800、400、200、100、40、20、10、4 μl,分别于5 ml容量瓶中用甲醇定容。制成浓度为40、20、10、5、2、1、0.5、0.2 μg/ml的对照品溶液。HPLC仪检测并记录峰面积A,绘制出峰面积A与对照品质量浓度C的标准曲线并进行线性回归分析。

    • 吸取雷帕霉素脂质体溶液500 μl加入5 ml容量瓶中,甲醇定容至刻度。超声20 min破乳后,以10 000 r/min进行超速离心10 min。取适量上清液过0.45 μm有机膜,制得供试品溶液。吸取空白脂质体按同法制备阴性对照品溶液。分别取对照品、阴性对照品、供试品按照“1.6.1”项下方法进样,记录HPLC图。

    • 选取低、中、高3个浓度的对照品溶液,1 d内重复进样考察日内精密度,连续3 d每天测定一次,考察日间精密度。

    • 吸取用于制备选定的低、中、高3个浓度对照品溶液的储备液于不同的5 ml容量瓶中,同一浓度共制备3个样品。向每个容量瓶中加入100 μl空白脂质体溶液,再用甲醇定容至刻度。超声20 min破乳后,进行超速离心,10 000 r/min,10 min。取适量上清液过0.45 μm有机膜,进行HPLC检测。

    • 包封率与载药量是评价脂质体的重要指标。包封率是脂质体中包封药物量与脂质体中药物总量的百分比。载药量是脂质体中药物量与脂质体总量的百分比。

      精密吸取脂质体500 μl置于5 ml容量瓶中,甲醇稀释至刻度。超声20 min破乳后,再进行超速离心,10 000 r/min,10 min。取适量上清液过0.45 μm有机膜,进行HPLC检测,计算得出脂质体中药物总量。

      精密吸取适量脂质体溶液,先进行低速离心[3],3 000 r/min,15 min。取上层液体500 μl置于5 ml容量瓶中用甲醇稀释至刻度。超声20 min破乳后,再进行超速离心,10 000 r/min,10 min。取适量上清液过0.45 μm有机膜,进行HPLC检测,计算出脂质体中包封药物量。

    • 采用反向透析法测定雷帕霉素脂质体光敏释放特性。以30 ml 20%乙醇为释放介质,加入50 ml离心管内;另吸取1 ml释放介质并加入透析袋内,将透析袋两端扎紧后放入离心管中;取300 μl雷帕霉素脂质体,用730 nm,1 W/cm2近红外光照射5 min后,转移至释放介质;将离心管移至摇床内,设置摇床条件为37 ℃,180 r/min。分别在1、2、4、8、12 h从透析袋内取样200 μl,用于样品测定和累积释放率的计算。取样后即补加新鲜释放介质200 μl,保持释放介质总量不变。以时间(t)为横坐标,以累积释放率(Q%)为纵坐标,绘制释放曲线。

    • 回归方程为A = 0.6240 C-0.1738 (r = 0.999 5)。雷帕霉素在0.2~40 μg/ml浓度范围内线性关系良好。

    • 按照“1.6.1”项下色谱条件测定,雷帕霉素出峰良好,保留时间为7.8 min。表明此方法专属性良好(图1)。

      图  1  雷帕霉素的专属性

    • 表1可知,雷帕霉素在低、中、高3个浓度都具有较好的准确度,日间精密度和日内精密度值均小于5%,表明该方法可用于雷帕霉素的含量测定。

      表 1  雷帕霉素 HPLC 分析的精密度($\overline x \; $±sn=3)

      浓度(μg/ml)日内精密度日间精密度
      检测值(μg/ml)RSD(%)检测值(μg/ml)RSD(%)
      0.50 0.58±0.011.62 0.58±0.011.13
      2.001.95±0.020.561.96±0.010.49
      10.009.36±0.040.4010.02±0.090.87
    • 表2可知,雷帕霉素在低、中、高3个浓度的回收率为97.64%~98.62%,符合95%~105%的范围,且RSD值均小于1%,表明该提取方法稳定可靠。

      表 2  雷帕霉素 HPLC 分析的提取回收率($\overline x \; $±sn=3)

      浓度(μg/ml)检测值(μg/ml)回收率(%)RSD(%)
      0.500.57±1.54113.471.69
      2.001.93±0.0296.480.82
      10.009.82±0.0598.210.52
    • 表3可知,包含不同摩尔量DLPC的处方制得的脂质体,成膜及水化效果较好,粒径<200 nm,PDI<0.2,雷帕霉素包封率>90%,载药量>1%;脂质体体外释放试验,光照12 h后,测得雷帕霉素药物累积释放率>60%(图2A)。当DLPC含量较低时(DSPC∶DLPC=69∶1),雷帕霉素释放速率明显低于其他处方。随着DLPC含量的增加,雷帕霉素释放速率及12 h内累积释放率并无明显增加。

      表 3  不同摩尔量DLPC脂质体的表征


      DSPC:DLPC
      (mol:mol)
      成膜水化粒径(l/nm)PDIZeta电位(mV)包封率(%)载药量(%)
      69∶1均匀无沉淀139.70.051−12.198.711.11
      65∶5均匀无沉淀173.20.194−12.594.201.23
      60∶10均匀无沉淀143.40.035−13.098.431.15
      50∶20均匀无沉淀126.70.165−14.992.642.27
      40∶30均匀无沉淀120.50.173−14.692.942.22
    • 表4可知,PC(DSPC+DLPC)与胆固醇之比过大(70∶10)或过小(70∶40),脂质体都不能成膜。当PC与胆固醇之比为70∶20、70∶25、70∶30时,所得脂质体成膜及水化效果较好,粒径<200 nm,PDI<0.2,雷帕霉素包封率>90%,载药量在1%左右。在进行脂质体体外释放实验中,测得12 h后雷帕霉素药物累积释放率>60%(图2B)。

      表 4  不同摩尔量胆固醇脂质体的表征

      PC∶胆固醇
      (mol∶mol)
      成膜水化粒径(l/nm)PDIZeta电位(mV)包封率(%)载药量(%)
      70∶10不均匀
      70∶20均匀无沉淀119.40.108−11.096.690.96
      70∶25均匀无沉淀173.20.194−12.594.201.23
      70∶30均匀无沉淀147.70.095−12.794.560.88
      70∶40不成膜

      图  2  雷帕霉素光敏释放特性考察

    • 表5可知,当DSPE-PEG2000用量较小时,脂质体不能成膜。当PC与DSPE-PEG2000之比为70∶5、70∶10、70∶15时,所得脂质体成膜及水化效果较好,粒径<200 nm,PDI<0.2,雷帕霉素包封率>90%,载药量>1%。在进行的12 h脂质体体外释放实验中,摩尔比70∶5组测得雷帕霉素药物累积释放率>60%,其余两组药物累积释放率在33%左右(图2C)。

      表 5  不同摩尔量DSPE-PEG2000脂质体的表征


      PC: DSPE-PEG2000
      (mol:mol)
      成膜水化粒径(l/nm)PDIZeta电位(mV)包封率(%)载药量(%)
      70∶0不成膜
      70∶1不成膜
      70∶5均匀无沉淀173.20.194−12.594.201.23
      70∶10均匀无沉淀136.20.144−12.198.131.37
      70∶15均匀无沉淀108.90.197−11.097.071.34
    • 表6可知,当PdPC(OBu)8用量较大(质量比1∶50),脂质体不能成膜。当PdPC(OBu)8与PC质量之比为1∶100、1∶200、1∶300、1∶400,测得粒径<200 nm,PDI<0.2,雷帕霉素包封率>90%,载药量>1%。在进行的12 h脂质体体外释放实验中,质量比1∶100、1∶200组释放效率高于其余两组,在60%左右(图2D)。

      表 6  不同用量PdPC(OBu)8脂质体的表征


      PdPC(OBu)8 :PC
      (m:m)
      成膜水化粒径(l/nm)PDIZeta电位(mV)包封率(%)载药量(%)
      1∶400均匀无沉淀179.30.140−12.393.921.15
      1∶300均匀无沉淀157.40.143−11.594.231.16
      1∶200均匀无沉淀145.90.142−14.393.261.19
      1∶100均匀无沉淀136.20.144−12.198.131.23
      1∶50 不均匀沉淀
    • DLPC是一种人工合成的不饱和磷脂,在制成的脂质体中,DLPC将均匀分散在脂质双分子层膜上。当有ROS存在时,DLPC结构中的不饱和碳碳双键可被氧化,使脂质膜结构遭到破坏,促进包载药物的释放。光敏剂可在特定波长光照射下产生ROS,在肿瘤疾病的光动力治疗中得到广泛应用。但光敏剂自身潜在的光毒性和溶解性差是其突出缺陷。本文将光敏剂包载在脂质体中可以减少潜在的细胞毒性,同时可增加其溶解度。在研究脂质体中雷帕霉素释放的释放介质确定上,文献[2,4-5]中提供了多种选择。预实验显示,20%乙醇溶液作为释放介质时,不仅克服了脂溶性药物雷帕霉素在水中溶解性差的缺点,同时也使得在进行HPLC检测时干扰峰较少。综上所述,本研究成功制备了光敏ROS响应型雷帕霉素脂质体,表征结果较好。在短时间特定波长照射后,可实现脂溶性药物的快速释放。

参考文献 (5)

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