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应中央军委要求,2022年9月起,《药学实践杂志》将更名为《药学实践与服务》,双月刊,正文96页;2023年1月起,拟出版月刊,正文64页,数据库收录情况与原《药学实践杂志》相同。欢迎作者踊跃投稿!

蜂斗菜总内酯对常压缺氧小鼠的保护作用研究

李炳锋 段雅倩 王旭 郭美丽 高越

李炳锋, 段雅倩, 王旭, 郭美丽, 高越. 蜂斗菜总内酯对常压缺氧小鼠的保护作用研究[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(4): 314-319. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202111085
引用本文: 李炳锋, 段雅倩, 王旭, 郭美丽, 高越. 蜂斗菜总内酯对常压缺氧小鼠的保护作用研究[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(4): 314-319. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202111085
LI Bingfeng, DUAN Yaqian, WANG Xu, GUO Meili, GAO Yue. Protective effects of the total bakkenolides from Petasites tricholobus on hypoxia mice under normobaric pressure[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(4): 314-319. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202111085
Citation: LI Bingfeng, DUAN Yaqian, WANG Xu, GUO Meili, GAO Yue. Protective effects of the total bakkenolides from Petasites tricholobus on hypoxia mice under normobaric pressure[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(4): 314-319. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202111085

蜂斗菜总内酯对常压缺氧小鼠的保护作用研究

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202111085
基金项目: 军队医学科技青年培育计划拔尖项目(18QNP017)
详细信息
    作者简介:

    李炳锋,硕士研究生. Tel:18758515788;Email:libf0930@163.com

    通讯作者: 郭美丽,教授,博士生导师. Tel:(021)81871302. Email:mlguo@126.com高 越,副教授,硕士生导师. Tel:(021)81871369;Email:gaoyue2000@hotmail.com
  • 中图分类号: R285

Protective effects of the total bakkenolides from Petasites tricholobus on hypoxia mice under normobaric pressure

  • 摘要:   目的  探讨蜂斗菜总内酯(PTB)对提高动物耐缺氧能力的作用。  方法  建立小鼠常压缺氧模型和PC12细胞氧糖剥夺模型(OGD),观察PTB对小鼠常压密闭空间下存活时间、血清乳酸脱氢酶(LDH)活性和丙二醛(MDA)含量,对脑组织与心脏超氧化物歧化酶(SOD)和还原型谷胱甘肽(GSH)的活性,以及对脑组织病理变化和细胞存活率的影响。  结果  PTB可以显著提高常压缺氧小鼠在密闭空间下的存活时间,提高机体SOD、GSH的活性,减少脂质过氧化物的产生,降低无氧酵解的程度,保护神经细胞的结构和功能,提高OGD处理后的细胞的存活率。  结论  PTB具有明显的提高小鼠耐缺氧能力的作用,其作用机制可能与清除氧自由基、抑制脂质过氧化反应、保护神经细胞结构和功能有关。
  • 图  1  HE染色观察小鼠脑组织病理变化(40×)

    A.空白对照组; B.模型组; C.阳性对照组(诺迪康);D.PTB低剂量组; E.PTB中剂量组; F.PTB高剂量组。

    图  2  尼氏染色观察小鼠脑组织病理变化( 40×)

    A.空白对照组; B.模型组; C.阳性对照组(诺迪康);D.PTB低剂量组; E.PTB中剂量组; F.PTB高剂量组。

    表  1  PTB对常压缺氧小鼠存活时间的影响(n=10,$\bar x $±s

    组别给药剂量(mg/kg)存活时间(t/s)
    模型组859.5±84.56
    诺迪康组280991.4±140.7*
    PTB低剂量组 201023±142.7**
    PTB中剂量组 40980±120.5*
    PTB高剂量组 801055±251.9*
    *P<0.05,**P<0.01,与模型组比较。
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    表  2  PTB对常压缺氧小鼠血清LDH活力和MDA含量的影响(n=10,$\bar x $±s

    组别给药剂量(mg/kg)LDH(U/L)MDA(nmol/ml)
    空白组1052±59.4967.04±12.63
    模型组1280±206.6##204.3±58.42##
    诺迪康组2801092±70.16*132.5±54.02*
    PTB低剂量组 201153±82.80138.3±32.50*
    PTB中剂量组 401097±100.5*152.8±48.90*
    PTB高剂量组 801059±187.8*172.7±60.54
    *P<0.05,与模型组比较;##P<0.01,与空白组比较。
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    表  3  PTB对常压缺氧小鼠脑组织和心脏GSH活力的影响(n=10,$\bar x $±s

    组别给药剂量
    (mg/kg)
    脑GSH
    (μmol/g•prot)
    心脏GSH
    (μmol/g•prot)
    空白组44.17±8.6729.123±2.906
    模型组31.99±5.528##5.772±2.537#
    诺迪康组28037.47±13.568.345±2.336*
    低剂量组 2043.38±10.46**13.42±3.606**
    中剂量组 4047.57±8.106**12.07±4.191**
    高剂量组 8050.36±17.18**12.59±1.820**
    *P<0.05,**P<0.01,与模型组比较;#P<0.05,##P<0.01,与空白组比较。
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    表  4  PTB对常压缺氧小鼠脑组织和心脏SOD活力的影响(n=10,$\bar x $±s

    组别给药剂量
    (mg/kg)
    脑SOD
    (U/mg•prot)
    心脏SOD
    (U/mg•prot)
    空白组71.75±19.92100.7±13.16
    模型组58.06±4.552#85.26±16.80#
    诺迪康组28056.88±14.44115.6±15.00**
    低剂量组 2068.98±10.70**139.7±25.62**
    中剂量组 4080.27±18.47**124.7±21.92**
    高剂量组 8079.60±21.02**127.1±12.15**
    **P<0.01,与模型组比较;#P<0.05,与空白组比较。
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    表  5  PTB对常压缺氧的PC12细胞损伤存活率的影响($\bar x $±s

    组别样本数(个)给药剂量(ng/ml)存活率(%)
    空白组3100.00±3.01
    模型组337.26±3.80###
    PTB低剂量组3 2046.08±4.91**
    PTB中剂量组3 20052.90±6.85***
    PTB高剂量组3200061.09±3.53***
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-11-23
  • 修回日期:  2022-04-19
  • 网络出版日期:  2022-07-27
  • 刊出日期:  2022-07-25

蜂斗菜总内酯对常压缺氧小鼠的保护作用研究

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202111085
    基金项目:  军队医学科技青年培育计划拔尖项目(18QNP017)
    作者简介:

    李炳锋,硕士研究生. Tel:18758515788;Email:libf0930@163.com

    通讯作者: 郭美丽,教授,博士生导师. Tel:(021)81871302. Email:mlguo@126.com高 越,副教授,硕士生导师. Tel:(021)81871369;Email:gaoyue2000@hotmail.com
  • 中图分类号: R285

摘要:   目的  探讨蜂斗菜总内酯(PTB)对提高动物耐缺氧能力的作用。  方法  建立小鼠常压缺氧模型和PC12细胞氧糖剥夺模型(OGD),观察PTB对小鼠常压密闭空间下存活时间、血清乳酸脱氢酶(LDH)活性和丙二醛(MDA)含量,对脑组织与心脏超氧化物歧化酶(SOD)和还原型谷胱甘肽(GSH)的活性,以及对脑组织病理变化和细胞存活率的影响。  结果  PTB可以显著提高常压缺氧小鼠在密闭空间下的存活时间,提高机体SOD、GSH的活性,减少脂质过氧化物的产生,降低无氧酵解的程度,保护神经细胞的结构和功能,提高OGD处理后的细胞的存活率。  结论  PTB具有明显的提高小鼠耐缺氧能力的作用,其作用机制可能与清除氧自由基、抑制脂质过氧化反应、保护神经细胞结构和功能有关。

English Abstract

李炳锋, 段雅倩, 王旭, 郭美丽, 高越. 蜂斗菜总内酯对常压缺氧小鼠的保护作用研究[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(4): 314-319. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202111085
引用本文: 李炳锋, 段雅倩, 王旭, 郭美丽, 高越. 蜂斗菜总内酯对常压缺氧小鼠的保护作用研究[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(4): 314-319. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202111085
LI Bingfeng, DUAN Yaqian, WANG Xu, GUO Meili, GAO Yue. Protective effects of the total bakkenolides from Petasites tricholobus on hypoxia mice under normobaric pressure[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(4): 314-319. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202111085
Citation: LI Bingfeng, DUAN Yaqian, WANG Xu, GUO Meili, GAO Yue. Protective effects of the total bakkenolides from Petasites tricholobus on hypoxia mice under normobaric pressure[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(4): 314-319. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202111085
  • 氧气是生命活动的基本物质,在机体内主要参与能量代谢过程。作为一种至关重要的生命物质,氧气在多个层面影响着机体,甚至可以通过多种渠道影响基因[1]。Kirmes等的研究表明:在缺氧条件下,细胞在全基因组水平上会产生结构变化,染色质会发生聚集现象[2]。机体缺氧时,通过氧化呼吸链产生过多的活性氧簇(ROS),包括超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基等。ROS不仅可以直接损伤脂质、蛋白质及核酸等生物大分子,还可以通过Fas/FasL、TNF-α/TNFRl、MAPK等信号通路诱导细胞凋亡[3-4]。目前,针对缺氧的防治,西药主要有碳酸酐酶抑制剂、糖皮质激素、茶碱等,中药较为成熟的有藏药红景天,胡黄连、黄芪等也被认为具有一定的抗缺氧损伤的能力[5]。乙酰唑胺作为FDA认可的唯一一种防治急性缺氧的药物,更多的是用来治疗急性缺氧,且其存在过敏反应、四肢麻木、疲劳、困倦等不良反应,肝肾功能异常的人不宜使用[6-8]。藏药红景天目前已被高原边防部队作为防治高原缺氧的常规药物。大部分学者认为红景天可以通过抑制氧化应激、抗凋亡、保护神经细胞等方式治疗缺氧性损伤,但其主要活性成分的抗缺氧作用机制仍不清楚[9]。作为预防用药,红景天需要提前7~15 d服用,才能较好起到提高抗缺氧能力的作用,疗程较长。目前,针对缺氧的治疗仍以给予高浓度氧气最为直接有效,而对于提高耐缺氧能力,目前尚无安全高效的药物。

    毛裂蜂斗菜(Petasites tricholobuson)是菊科蜂斗菜属下的一种,在民间广泛用于消肿止痛、解毒祛瘀,治跌打损伤、毒蛇咬伤等。课题组前期实验已经证明,其醇提取物具有抗炎作用[10-12]。本实验通过观察PTB对小鼠存活时间、血清乳酸脱氢酶(LDH)活性和丙二醛(MDA)含量变化,对脑组织与心脏超氧化物歧化酶(SOD)和还原型谷胱甘肽(GSH)活性变化、脑组织病理变化,以及对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)制成糖氧剥夺模型(OGD)后存活率的影响,进一步探讨PTB的抗缺氧能力及可能的作用机制。

    • 昆明种小鼠110只,雄性,SPF级,体质量23~25 g,合格证号:SCXK(京)2019-0010(斯贝福生物技术有限公司),饲养于清洁级动物房,人工照明模拟昼夜变化;PC12细胞(美国ATCC细胞库)。

    • 蜂斗菜总内酯(自提):经高效液相色谱(HPLC)检测,蜂斗菜总内酯含量为74.8%,其中,内酯B、内酯Ⅲa、内酯Ⅳa的含量分别为13.4%、46.8%、14.6%,各单体成分分子结构式均已明确[13];诺迪康胶囊(规格:0.28 g/粒,西藏诺迪康药业股份有限公司,批号:200402);0.9%氯化钠溶液(500 ml,济民健康管理股份有限公司,批号:S200516E52);LDH试剂盒、GSH试剂盒、总蛋白定量测试盒、MDA试剂盒、SOD测试盒(南京建成生物工程研究所),规格:96T,批号:20210914、20211012、20210603、20211012、20211012;MTT(3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)(美国Sigma 公司);高糖DMEM培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司);混合气体(95%N2,5%CO2)(上海成功气体工业有限公司);CO2气体(海军军医大学热卫系)。

    • 全自动酶标仪、1300 SERIES A2型超净台(美国Thermo科技公司);SHIMADZU LC-20高效液相色谱仪(岛津有限公司);Pico17高速离心机(ThermoFisher科技公司);L-420低速离心机(湘仪离心机仪器有限公司);Tissuelyser-48多样品组织研磨机(上海净信实业发展有限公司);DHG.9.23A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);DK-8D型电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司)。

    • 小鼠适应性饲养3 d,常规进食,自由饮水。根据预实验结果,采用随机数字法将小鼠分为空白对照组、模型组、阳性对照组(诺迪康280 mg/kg)、PTB低剂量组(20 mg/kg)、PTB中剂量组(40 mg/kg)、PTB高剂量组(80 mg/kg),其中空白对照组10只小鼠,其余各组20只小鼠。适应性饲养3 d后,按照小鼠质量10 ml/kg灌胃给药,连续给药3 d,空白对照组和模型组给予等体积的溶剂CMC-Na。本实验过程遵守动物福利、动物保护和伦理原则及相关规定。

    • 第3天给药1 h后,除空白对照组外,取其余每组小鼠各10只分别置于125 ml磨口广口瓶中(瓶内放置5 g钠石灰,用于吸附CO2),瓶口涂抹凡士林保证绝对密封,自盖上瓶盖开始计时,以小鼠呼吸心跳停止为小鼠窒息死亡判定依据,记录并统计各组小鼠死亡时间。

    • 根据小鼠常压密闭缺氧实验结果,将小鼠最短死亡时间(12 min)设为时间节点。除空白对照组外,将其余5组剩余小鼠分别置于125 ml磨口广口瓶中(瓶内放置5 g钠石灰,用于吸附CO2),瓶口涂抹凡士林保证绝对密封。自盖上瓶盖开始计时,到达时间节点后立即将小鼠取出,眼眶取血,血液样品放置于冰盒中保存。空白对照组于常压未缺氧条件下直接眼眶取血。各组小鼠眼眶取血后,立即脱颈处死,解剖并小心分离出脑组织,于冰盘上快速分离出右侧大脑半球,置4%多聚甲醛固定液中。左侧大脑半球保存在清洁干燥离心管中。脑组织固定后,解剖分离出小鼠心脏,用生理盐水充分灌洗后,用清洁滤纸吸干。所有样品均放置于液氮中临时保存。

    • 将各组小鼠右侧大脑半球切片制作成石蜡切片,分别通过脱蜡、染色、分化、封片等步骤,进行HE和尼氏染色。染色切片制作完成后进行显微镜镜检,图像采集分析。

    • 将取得的血液样品进行离心处理(4000 r/min,10 min),取上清液进行LDH活性、MDA含量的测定。将取得的心脏、左侧大脑半球称重,按照组织与生理盐水1∶9的比例,低温条件下制成10%的组织匀浆,进行SOD、GSH活性的测定。MDA含量、LDH活性、SOD活性、GSH活性的检测按照试剂盒说明书进行。

    • 将PC12细胞置于CO2细胞培养箱内培养(95%空气和5%CO2,37 ℃,饱和湿度),培养基由90%高糖DMEM和10%胎牛血清(FBS)组成,每3 d更换新的培养基。当细胞的生长达到80%~90%汇合度时,对细胞进行传代培养。细胞传代时,先弃去培养瓶内的培养基,用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次,加入不含EDTA的胰酶消化细胞,按照1:4的比例进行传代分瓶培养。待细胞生长状态稳定处于对数期生长时进行后续实验。

    • 称取适量蜂斗菜总内酯,加入无糖培养基配制成2000 ng/ml的溶液。按照比例,用无糖培养基将液体分别稀释为200 ng/ml和20 ng/ml的溶液。

    • 待铺于细胞培养板内的细胞汇合度达到80%且生长状态良好时,将原有培养基弃去,PBS冲洗2次后,模型组加入无糖培养基,给药组加入含有不同浓度PTB(20 、200、2000 ng/ml)的无糖培养基,置于缺氧装置(95% N2,5% CO2)内缺氧2 h后,将该装置移入37 ℃的恒温培养箱继续孵育12 h形成OGD模型。空白对照组照常更换培养基一次,在正常细胞培养环境下培养。

    • 将状态良好的细胞以5×104个/ml的密度铺于96孔细胞培养板,MTT法检测细胞存活率。MTT实验检测开始时,在各细胞培养孔中加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml, 即0.5%MTT),继续在37 ℃细胞培养箱内孵育4 h。弃细胞上清液,每个细胞孔加入150 μl DMSO溶液,摇床上低速震荡10 min,使沉积在细胞内的结晶充分溶解。在酶标仪490 nm处测量各孔的吸光值(A值)。根据各组所得的A值,计算细胞的存活率,其中,未经OGD处理的空白组细胞的存活率均一化为100%,其余各组细胞的存活率是相对于空白组比值的百分比。细胞的存活率=(A实验组/ A空白组)×100%。

    • 采用SPSS21.0统计分析软件处理。计量资料数据以($\bar{x}$±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,当P<0.05时,表示差异有统计学意义。

    • 常压缺氧条件下,模型组小鼠的平均存活时间为859.5 s。与模型组相比,阳性对照组(诺迪康)小鼠的存活时间延长了131.9 s(P<0.05),PTB低、中、高剂量均能显著延长小鼠的存活时间(P<0.05,P<0.01),结果见表1

      表 1  PTB对常压缺氧小鼠存活时间的影响(n=10,$\bar x $±s

      组别给药剂量(mg/kg)存活时间(t/s)
      模型组859.5±84.56
      诺迪康组280991.4±140.7*
      PTB低剂量组 201023±142.7**
      PTB中剂量组 40980±120.5*
      PTB高剂量组 801055±251.9*
      *P<0.05,**P<0.01,与模型组比较。
    • 与空白对照组相比,模型组的LDH活力明显增高(P<0.01);与模型组相比,阳性对照组(诺迪康)、PTB中、高剂量组LDH活力降低至空白组水平(P<0.05);低剂量组的LDH活力较模型组有所降低,但没有统计学差异(P>0.05),见表2

      表 2  PTB对常压缺氧小鼠血清LDH活力和MDA含量的影响(n=10,$\bar x $±s

      组别给药剂量(mg/kg)LDH(U/L)MDA(nmol/ml)
      空白组1052±59.4967.04±12.63
      模型组1280±206.6##204.3±58.42##
      诺迪康组2801092±70.16*132.5±54.02*
      PTB低剂量组 201153±82.80138.3±32.50*
      PTB中剂量组 401097±100.5*152.8±48.90*
      PTB高剂量组 801059±187.8*172.7±60.54
      *P<0.05,与模型组比较;##P<0.01,与空白组比较。

      与空白对照组相比,模型组的MDA含量显著增高(P<0.01);与模型组相比,阳性对照组(诺迪康)、PTB低、中剂量组MDA含量降低(P<0.05);PTB高剂量组MDA含量有所降低,但没有统计学差异(P>0.05),见表2

    • 在脑组织中,与空白对照组相比,模型组的GSH活力降低(P<0.01);与模型组相比,阳性对照组(诺迪康)的GSH活力有所升高,但是没有统计学差异(P>0.05);与模型组相比,PTB低、中、高3个剂量组的GSH活力均显著升高(P<0.01),见表3

      表 3  PTB对常压缺氧小鼠脑组织和心脏GSH活力的影响(n=10,$\bar x $±s

      组别给药剂量
      (mg/kg)
      脑GSH
      (μmol/g•prot)
      心脏GSH
      (μmol/g•prot)
      空白组44.17±8.6729.123±2.906
      模型组31.99±5.528##5.772±2.537#
      诺迪康组28037.47±13.568.345±2.336*
      低剂量组 2043.38±10.46**13.42±3.606**
      中剂量组 4047.57±8.106**12.07±4.191**
      高剂量组 8050.36±17.18**12.59±1.820**
      *P<0.05,**P<0.01,与模型组比较;#P<0.05,##P<0.01,与空白组比较。

      在心脏中,与空白对照组相比,模型组的GSH活力降低(P<0.05);与模型组相比,阳性对照组(诺迪康)的GSH活力升高(P<0.05);与模型组相比,PTB低、中、高3个剂量组的GSH活力均显著升高(P<0.01),见表3

    • 在脑组织中,与空白对照组相比,模型组的SOD活力降低(P<0.05);与模型组相比,阳性对照组(诺迪康)的SOD活力变化没有统计学差异(P>0.05);与模型组相比,PTB低、中、高3个剂量组的SOD活力均显著升高(P<0.01),见表4

      表 4  PTB对常压缺氧小鼠脑组织和心脏SOD活力的影响(n=10,$\bar x $±s

      组别给药剂量
      (mg/kg)
      脑SOD
      (U/mg•prot)
      心脏SOD
      (U/mg•prot)
      空白组71.75±19.92100.7±13.16
      模型组58.06±4.552#85.26±16.80#
      诺迪康组28056.88±14.44115.6±15.00**
      低剂量组 2068.98±10.70**139.7±25.62**
      中剂量组 4080.27±18.47**124.7±21.92**
      高剂量组 8079.60±21.02**127.1±12.15**
      **P<0.01,与模型组比较;#P<0.05,与空白组比较。

      在心脏中,与空白对照组相比,模型组的SOD活力降低(P<0.05);与模型组相比,阳性对照组(诺迪康)、PTB低、中、高3个剂量组的SOD活力均显著升高(P<0.01),见表4

    • 图1所示,与空白对照组相比,模型组小鼠神经细胞排列明显紊乱,细胞之间存在大量空泡(箭头所示);与模型组相比,阳性对照组及PTB中、高剂量组的小鼠脑组织排列较整齐,细胞间空泡较少,神经纤维束的走行较为整齐统一。

      图  1  HE染色观察小鼠脑组织病理变化(40×)

      尼氏染色下,与空白对照组相比,模型组海马区尼氏小体(箭头所示)明显减少,海马区细胞排列紊乱;与模型组相比,阳性对照组及PTB各剂量组的尼氏小体明显增加,细胞排列规则,见图2

      图  2  尼氏染色观察小鼠脑组织病理变化( 40×)

    • 表5所示,空白组细胞存活率为100.00%,模型组细胞存活率下降至(37.26±3.80) %,与空白组相比存在非常显著性差异(P<0.001)。PTB在20、200、2000 ng/ml浓度下的细胞存活率分别为(46.08±4.91) %、(52.90±6.85) %、(61.09±3.53) %,各浓度组相对于OGD组均有显著性差异(P<0.01,P<0.001,P<0.001)。

      表 5  PTB对常压缺氧的PC12细胞损伤存活率的影响($\bar x $±s

      组别样本数(个)给药剂量(ng/ml)存活率(%)
      空白组3100.00±3.01
      模型组337.26±3.80###
      PTB低剂量组3 2046.08±4.91**
      PTB中剂量组3 20052.90±6.85***
      PTB高剂量组3200061.09±3.53***
    • 缺氧条件下,由于ATP代谢障碍、机体代谢增强、体内Ca2+浓度增加等原因,产生过量的氧自由基。氧自由基通过损伤生物膜、蛋白质、DNA和糖分子,影响细胞信号传导和细胞凋亡,对机体产生损伤[14-15]

      课题组前期通过建立减压缺氧模型,测定实验动物存活率、血糖、肝糖原、肌糖原、ATP、乳酸(LD)、LDH等指标,论证了PTB具有维持血糖稳定,提高机体主要脏器中的糖原以及ATP的含量,减少LD积蓄以及LDH的活性,改善机体能量代谢的作用[13]。本论文采用常压缺氧模型进一步检测了在缺氧条件下,PTB对实验动物体内SOD、GSH、LDH活性、MDA含量、脑组织病理改变、对OGD处理后细胞存活状态等指标的影响,进一步完善了其对缺氧实验动物的保护作用。SOD被认为是抗氧化系统的第一道防线,是一种能够专一清除氧自由基的酶。它通过降低氧化活性部位金属离子的活性,以两步快速反应使${\rm{O}}^-_2$转变为H2O2和O2。H2O2再被过氧化氢酶还原成H2O[16-17]。GSH是一种非酶性抗氧化剂,通过其巯基氧化-还原态的转换,作为可逆的供氢体,和过氧化物及自由基结合,保护细胞膜中含巯基的蛋白质不被破坏[18]。在本实验中,PTB在低、中、高3个剂量下,均能显著增强缺氧小鼠心、脑组织中SOD、GSH的活性,提高机体清除氧自由基的能力,减轻缺氧损伤。

      脂质过氧化物(LPO)是人体内多聚不饱和脂肪酸和氧自由基结合后形成的。在缺氧条件下,LPO水平升高,机体细胞及细胞膜产生氧化反应,溶解细胞膜表面的磷脂,破坏细胞膜的生理结构[19]。LPO还能和细胞内的DNA、脂质、蛋白质形成复合物,刺激新陈代谢改变,导致细胞内信号传导的紊乱、功能障碍,甚至凋亡。MDA是LPO稳定的终产物[20]。LDH是生物体内氧化还原的重要酶系之一,它能可逆地催化乳酸氧化为丙酮酸。当机体缺氧时,主要参与葡萄糖的无氧代谢。LDH活性的升高是机体无氧酵解程度升高的重要提示之一[21]。在本实验中,PTB中、高剂量组小鼠的血清LDH含量较模型组相比明显降低,说明中、高剂量组小鼠的无氧酵解相对较少,反应出机体缺氧程度较轻。低、中剂量组小鼠的MDA含量较模型组相比明显降低,说明小鼠体内发生脂质过氧化反应相对较低。这说明PTB可以抑制缺氧条件下机体的脂质过氧化反应,改善机体缺氧程度。

      行为学实验结果显示,PTB在各剂量下均可延长常压缺氧小鼠在密闭空间下的存活时间。脑组织HE染色和尼氏染色表明,PTB具有保护神经细胞,维持细胞形态及功能的作用。体外实验结果表明,PTB在20、200、2000 ng/ml浓度下均能够提高OGD诱导的PC12细胞损伤存活率,存在一定的剂量依赖性,说明PTB对神经细胞的损伤具有保护作用。

      综上所述,蜂斗菜总内酯具有明显的提高小鼠耐缺氧能力的作用,其作用机制可能与清除氧自由基、抑制脂质过氧化反应、保护神经细胞结构和功能有关。相比于藏药红景天,蜂斗菜总内脂的用药量明显减少,可作为抗缺氧的天然药物,进一步研究其作用的通路机制。

参考文献 (21)

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