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应中央军委要求,2022年9月起,《药学实践杂志》将更名为《药学实践与服务》,双月刊,正文96页;2023年1月起,拟出版月刊,正文64页,数据库收录情况与原《药学实践杂志》相同。欢迎作者踊跃投稿!

基于UHPLC-Q-TOF/MS技术快速分析消痰通腑方化学成分

秦烨 黄玮 顾雨芳 张慈安 修丽娟 唐继贵 张凤 刘煊

秦烨, 黄玮, 顾雨芳, 张慈安, 修丽娟, 唐继贵, 张凤, 刘煊. 基于UHPLC-Q-TOF/MS技术快速分析消痰通腑方化学成分[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(4): 339-346. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202109029
引用本文: 秦烨, 黄玮, 顾雨芳, 张慈安, 修丽娟, 唐继贵, 张凤, 刘煊. 基于UHPLC-Q-TOF/MS技术快速分析消痰通腑方化学成分[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(4): 339-346. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202109029
QIN Ye, HUANG Wei, GU Yufang, ZHANG Ci’an, XIU Lijuan, TANG Jigui, ZHANG Feng, LIU Xuan. Rapid analysis of chemical components of Xiaotan Tongfu formula based on UHPLC-Q-TOF/MS[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(4): 339-346. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202109029
Citation: QIN Ye, HUANG Wei, GU Yufang, ZHANG Ci’an, XIU Lijuan, TANG Jigui, ZHANG Feng, LIU Xuan. Rapid analysis of chemical components of Xiaotan Tongfu formula based on UHPLC-Q-TOF/MS[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(4): 339-346. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202109029

基于UHPLC-Q-TOF/MS技术快速分析消痰通腑方化学成分

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202109029
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(No.81804008)
详细信息
    作者简介:

    秦 烨,硕士,主管药师,研究方向:医院药学、临床药学,Email:kiki.807@163.com

    通讯作者: 张 凤,博士,副主任药师,研究方向:生药学、临床药学,Email:fengzhangky@aliyun.com刘 煊,博士,副主任医师,研究方向:中西医结合防治消化系统疾病,Email:18616630816@163.com
  • 中图分类号: R284

Rapid analysis of chemical components of Xiaotan Tongfu formula based on UHPLC-Q-TOF/MS

  • 摘要:   目的  探明消痰通腑方的主要化学成分,为方剂药效物质基础研究和临床治疗提供科学依据。  方法  采用超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱法(UHPLC-Q-TOF/MS)对消痰通腑方化学成分进行鉴定,色谱条件为Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1mm×100 mm,1.7 μm),以 0.1%甲酸水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱,柱温30 °C,流速0.3 ml/min,进样量1 μl,检测波长254 nm;质谱条件为电喷雾离子源(ESI),正、负离子全扫描模式采集质谱数据,根据对照品、自建质谱数据库和在线获得的化合物质谱数据库对色谱峰进行物质鉴定。  结果  初步鉴定出55个化合物,分别来自黄连、重楼、大黄、天南星、法半夏。  结论  本文所建立的UHPLC-Q-TOF/MS方法能系统、准确地鉴别消痰通腑方的化学成分,可为该方剂的质量标志物筛选和有效成分研究提供参考。
  • 图  1  混合对照品的UHPLC-Q-TOF/MS色谱图

    A.正离子模式;B.负离子模式

    图  2  消痰通腑方的UHPLC-Q-TOF/MS色谱图

    A.水提液正离子模式;B.水提液负离子模式;C.70%甲醇提取物正离子模式;D.70%甲醇提取物负离子模式

    表  1  消痰通腑方的鉴定分析结果

    序号质量相对时间(min)分子式m/z(MS1)部分特征离子峰m/z (MS2)差异(Δ ppm)名称来源药材来源文献
    1174.11150.906C6H14N4O2175.1193[M+H]+175,158,116−1.01精氨酸黄连*,制半夏[8,11]
    174.11130.906173.1036[M-H]-173,131−2.40
    2192.06170.965C7H12O6191.0552[M-H]-191,173,111−4.71奎宁酸黄连[8]
    3251.10220.996C10H13N5O3252.1093[M+H]+252,194,1370.79脱氧腺苷重楼,制半夏[11-12]
    4192.02811.189C6H8O7230.9906[M+K]+1.73柠檬酸黄连[12]
    192.02761.168191.0203[M-H]-191,111,1033.14
    5332.07671.394C13H16O10333.0878[M+H]+4.61没食子酸-3-O-β-D-葡萄糖苷大黄*[13]
    332.07461.395331.0672[M-H]-271,1690.30
    6170.02161.396C7H6O5171.0289[M+H]+171,155,1530.29没食子酸大黄*[13]
    170.02161.520169.0143[M-H]-125,1110.42
    7131.09451.508C6H13NO2132.1018[M+H]+132,86−0.76异亮氨酸天南星,制半夏[11,14]
    131.09391.475130.0869[M-H]-−3.84
    8165.0792.273C9H11NO2166.0864[M+H]+166,1200.60苯丙氨酸天南星,制半夏[11,14]
    165.07922.238164.0723[M-H]-3.66
    9354.09463.752C16H18O9353.0874[M-H]-353,191−1.13绿原酸黄连*[8]
    10204.08994.31-C11H12N2O2205.0973[M+H]+159,1460.10色氨酸黄连*,制半夏[8,11]
    204.08974.207203.0819[M-H]-142,116−0.69
    11326.10264.812C15H18O8325.0919[M-H]-325,235,1452.86对香豆酸-O-葡萄糖苷大黄[13]
    12452.13275.06-C21H24O11475.1211[M+Na]+0.00儿茶素-O-葡萄糖苷 /表儿茶素-O-葡萄糖苷大黄[13]
    452.13194.993451.1239[M-H]-451,137−1.55
    13578.1435.392C30H26O12579.1505[M+H]+0.94原花青素B2大黄*[13]
    578.14175.277577.1345[M-H]-577,289−1.23
    14290.07976.073C15H14O6291.0867[M+H]+1611.37儿茶素大黄[13]
    290.07945.995289.0721[M-H]-245,203,1871.04
    15194.05866.076C10H10O4217.0492[M+Na]+177,1454.68阿魏酸大黄[13]
    16654.19496.449C33H34O14653.1871[M-H]-653,313,169−0.774-( 4'-羟基苯基) -2-丁酮-O-阿魏酰-没食子酰-葡萄糖苷大黄[13]
    17484.08586.826C20H20O14483.078[M-H]-313,1690.00没食子酸-O-没食子酰基葡萄糖苷大黄[15]
    18164.04708.434C9H8O3163.0397[M-H]-163,155−2.45对香豆酸大黄[13]
    19564.14928.589C26H28O14565.1559[M+H]+565,5051.24夏佛托苷天南星[16]
    564.14788.556563.1418[M-H]-2.13
    20322.10938.578C19H16NO4+323.1163[M+H]+265,1893.40格兰地新黄连[17]
    21284.06878.920C16H12O5285.076[M+H]+2421.05大黄素甲醚大黄[18]
    22564.18719.192C27H32O13587.1756[M+Na]+356,3223.58鼠李糖甘草苷法半夏[16]
    23234.05339.318C12H10O5235.0604[M+H]+222,1891.282-甲基-5-羧甲基-7-羟基色原酮大黄[13]
    234.05319.262233.0458[M-H]-1.29
    24578.16419.686C27H30O14577.1554[M-H]-577,146−1.55异佛莱心苷法半夏[11]
    25442.09219.820C22H18O10443.0976[M+H]+393,1234.81表儿茶素没食子酸酯大黄[13]
    442.09019.820441.0824[M-H]-0.23
    26550.17049.845C26H18O10549.1614[M-H]-283,2390芹糖异甘草苷法半夏[10]
    27446.08569.912C21H18O11469.0733[M+Na]+279,248−1.71大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷大黄[15]
    446.08489.845445.0772[M-H]-−0.90
    28478.14719.978C23H26O11479.1551[M+H]+0.63异莲花掌苷大黄[15]
    478.14729.922477.14[M-H]-313−0.42
    29310.105810.092C15H18O7333.0949[M+Na]+1.202-O-桂皮-β-D-葡萄糖苷大黄[13]
    310.105510.002355.1035[M+HCOOH-H]-3450.00
    30234.089710.684C13H14O4235.097[M+H]+2352.132-(2′-羟丙基)-5-甲基-7-羟基色原酮大黄[13]
    234.089510.631233.0822[M-H]-1.29
    31862.195310.833C42H38O20861.1888[M-H]-699,6540.46番泻苷 B大黄[13]
    32320.089311.572C19H14NO4321.0991[M+H]+292,234−1.90黄连碱黄连[19]
    33399.166512.363C22H25NO6422.1598[M+Na]+350,336,2924.69秋水仙碱天南星[20]
    34462.116112.313C22H22O11461.1088[M-H]-461,331,169−0.22桂皮酸-O-没食子酰-葡萄糖苷大黄[9]
    35418.125713.394C21H22O9417.1188[M-H]-255,213−0.72异甘草苷法半夏[10]
    361048.543814.102C51H84O221071.5336[M+Na]+869,577−0.93重楼皂苷G重楼[21]
    1048.545714.0781047.5386[M-H]-0.48
    37408.142214.182C20H24O9431.1314[M+Na]+306,2920.236-甲氧基酸模素-8-O-β-D-葡萄糖苷大黄[13]
    408.142414.112407.1352[M-H]-0.98
    38432.105314.372C21H20O10455.0942[M+Na]+455,292−1.54芦荟大黄素-3-羟甲基-O-葡萄糖苷大黄[13]
    432.106014.317431.0989[M-H]-1.16
    391046.528314.384C51H82O221047.5356[M+H]+415,172−1.43polyphylloside III重楼[20]
    1046.528214.8521091.5286[M+HCOOH-H]-0.55
    40416.110914.554C21H20O9439.0999[M+Na]+439,336−0.23大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷大黄[13]
    416.110414.487415.1032[M-H]-−0.72
    41286.04815.273C15H10O6287.0552[M+H]+0.74木犀草素黄连*[8]
    286.048415.216285.0412[M-H]-285,215,1992.20
    42446.121315.932C22H22O10469.1104[M+Na]+469,283−0.21大黄素甲醚-8-O-β-D葡萄糖苷大黄[15]
    284.068715.865283.0616[M-H]-1.41
    43450.152317.150C22H26O10473.1413[M+Na]+473,230−1.06决明柯酮-O-乙酰基葡萄糖苷大黄[15]
    450.152817.097449.1469[M-H]-3.56
    44838.396917.208C42H62O17837.3886[M-H]-661,351−3.34甘草皂苷G2法半夏[10]
    45822.401217.943C42H62O16845.392[M+Na]+−3.17甘草酸法半夏*[10]
    822.403117.914821.3959[M-H]-351,193−0.83
    46284.032818.384C15H8O6283.0257[M-H]-2393.18大黄酸大黄[18]
    47884.477919.643C15H20O3907.4652[M+Na]+685,292−1.10纤细薯蓣皂苷重楼[21]
    884.476219.622929.4748[M+HCOOH-H]-−0.43
    48870.462219.768C44H70O17893.4502[M+Na]+376,251−0.34重楼皂苷H重楼[21]
    870.460719.622915.459[M+HCOOH-H]-−0.55
    49854.466419.773C44H70O16877.4557[M+Na]+877,306−1.31重楼皂苷II重楼[21]
    870.464619.750869.4546[M-H]-0.69
    50738.421919.932C39H62O13783.4170[M+HCOOH-H]-783,146−0.26重楼皂苷VI重楼[21]
    51270.053720.820C15H10O5269.0460[M-H]-225,1461.86芦荟大黄素大黄[18]
    52868.48222.136C45H72O16891.4746[M+Na]+725,4153.70薯蓣皂苷重楼[22]
    868.48222.104913.4809[M+HCOOH-H]-0.77
    53854.466822.323C44H70O16877.4572[M+Na]+196,1400.43重楼皂苷I重楼*[21]
    854.465522.297899.4609[M+HCOOH-H]-−1.07
    54254.057722.790C15H10O4255.0647[M+H]+196−1.96大黄酚大黄[18]
    55576.442827.329C35H60O6599.4282[M+Na]+429,3556.67胡萝卜苷天南星*[23]
    576.437427.263621.4349[M+HCOOH-H]-−2.68
    注:*表示在水提液中未检测出的化合物
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-09-06
  • 修回日期:  2022-03-03
  • 网络出版日期:  2022-07-27
  • 刊出日期:  2022-07-25

基于UHPLC-Q-TOF/MS技术快速分析消痰通腑方化学成分

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202109029
    基金项目:  国家自然科学基金资助项目(No.81804008)
    作者简介:

    秦 烨,硕士,主管药师,研究方向:医院药学、临床药学,Email:kiki.807@163.com

    通讯作者: 张 凤,博士,副主任药师,研究方向:生药学、临床药学,Email:fengzhangky@aliyun.com刘 煊,博士,副主任医师,研究方向:中西医结合防治消化系统疾病,Email:18616630816@163.com
  • 中图分类号: R284

摘要:   目的  探明消痰通腑方的主要化学成分,为方剂药效物质基础研究和临床治疗提供科学依据。  方法  采用超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱法(UHPLC-Q-TOF/MS)对消痰通腑方化学成分进行鉴定,色谱条件为Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1mm×100 mm,1.7 μm),以 0.1%甲酸水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱,柱温30 °C,流速0.3 ml/min,进样量1 μl,检测波长254 nm;质谱条件为电喷雾离子源(ESI),正、负离子全扫描模式采集质谱数据,根据对照品、自建质谱数据库和在线获得的化合物质谱数据库对色谱峰进行物质鉴定。  结果  初步鉴定出55个化合物,分别来自黄连、重楼、大黄、天南星、法半夏。  结论  本文所建立的UHPLC-Q-TOF/MS方法能系统、准确地鉴别消痰通腑方的化学成分,可为该方剂的质量标志物筛选和有效成分研究提供参考。

English Abstract

秦烨, 黄玮, 顾雨芳, 张慈安, 修丽娟, 唐继贵, 张凤, 刘煊. 基于UHPLC-Q-TOF/MS技术快速分析消痰通腑方化学成分[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(4): 339-346. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202109029
引用本文: 秦烨, 黄玮, 顾雨芳, 张慈安, 修丽娟, 唐继贵, 张凤, 刘煊. 基于UHPLC-Q-TOF/MS技术快速分析消痰通腑方化学成分[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(4): 339-346. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202109029
QIN Ye, HUANG Wei, GU Yufang, ZHANG Ci’an, XIU Lijuan, TANG Jigui, ZHANG Feng, LIU Xuan. Rapid analysis of chemical components of Xiaotan Tongfu formula based on UHPLC-Q-TOF/MS[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(4): 339-346. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202109029
Citation: QIN Ye, HUANG Wei, GU Yufang, ZHANG Ci’an, XIU Lijuan, TANG Jigui, ZHANG Feng, LIU Xuan. Rapid analysis of chemical components of Xiaotan Tongfu formula based on UHPLC-Q-TOF/MS[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(4): 339-346. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202109029
  • 消痰通腑方应用于治疗胃肠癌前病变患者已有十余年,能够延缓胃肠癌前患者向肿瘤的进展,同时对脓毒症等危重症患者的胃肠功能恢复有较好疗效[1-5]。该方剂由法半夏、生大黄、制大黄、制南星、重楼和黄连六味中药配伍组成,法半夏、制大黄为主药,旨在消痰止呕、泄下通俯之意。半夏乃燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结之良药,法半夏为半夏的炮制品,倍其化痰之力;制大黄为生大黄炒制,泻下力缓,能通达肠腑而推陈出新,又不伤正气,两者合用,既燥湿化痰,又缓消积滞,达消痰通腑之功。黄连既能泻脾胃之火,又能燥痰饮之湿。

    目前对该方剂的研究集中在药理功效方面,尚无对该方剂化学成分、有效成分的相关研究报道。寻找中药复方的临床药效基础,是长期困扰中医人临床研究的难点。超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱法(UHPLC-Q-TOF/MS)是一种简便、快速、高灵敏度的现代分析技术,能够提供化合物的精确分子量、元素组成以及离子碎片信息(MS1和MS),广泛用于中药化学成分的快速分析和鉴别[6-7]。本研究拟采用此方法对消痰通腑方的化学成分开展研究,为其质量标志物筛选和探明药效物质提供实验依据。

    • Agilent 1290 Infinity型超高效液相色谱和 6530型四极杆-飞行时间串联质谱仪(美国安捷伦);CPA255D型1/10万电子天平(德国Sartorius);Eppendorf mini spin离心机、Eppendorf 5430r离心机(德国Eppendorf);Lyovapor L-200冷冻干燥机(瑞士BUCHI);Milli-Q型纯水系统(美国Millipore);SK7200H型超声仪(上海科导超声仪器有限公司)。

      甘草酸(批号:F610137)、重楼皂苷I(批号:F278755)、重楼皂苷II(批号:F297228)、重楼皂苷VI(批号:F483230)、薯蓣皂苷(批号:F543583)、重楼皂苷H(批号:F297228)、奎宁酸(批号:F435708)、柠檬酸(批号:F594530)、异佛莱心苷(批号:F109963)、芹糖异甘草苷(批号:F667242)购自上海一飞生物科技有限公司,异佛莱心苷纯度为95%,其余对照品纯度均≥98%;芦荟大黄素(批号:D1226AS)、大黄素甲醚(批号:O1026AS)、大黄酚(批号:D0316AS)、大黄酸(批号:N1107AS)购自大连美仑生物科技有限公司,纯度均≥98%;水为去离子水;甲醇、乙腈、甲酸(质谱纯,德国E. Merck公司);其余试剂均为分析纯。

      消痰通腑免煎剂由法半夏、生大黄、制大黄等药物组成。由江阴制药厂生产,长征医院监制,生产批号:20200420。

    • 精密称定免煎剂0.5 g,加入70%甲醇50 ml,超声提取30 min,得70%甲醇提取物(简称醇提液);精密称定免煎剂0.5 g,加入70~80°C热水50 ml,搅拌5 min,超声提取30 min得水提液。提取液于3000 r/min离心10 min,取上层溶液1.5 ml置离心管中,再经15000 r/min离心10 min,取上清液过0.22 μm 微孔滤膜,即得。

    • 精密称取适量甘草酸、芦荟大黄素等对照品,加甲醇分别制成每1 ml 含对照品1 mg的储备溶液。精密吸取上述储备溶液各10 μl,置于1.5 ml 离心管中混合,涡旋混匀,加入甲醇配制成各对照品浓度分别为10 μg/ml的混合标准溶液。

    • 从已有的药材化合物成分分析文献中获取该方剂各味药的成分信息,确保数据库中收录的化合物能够在已发表的文献中检索可得,在基于Agilent自带的defult文档上建立方剂化合物数据库。采用Agilent MassHunter Qualitative Analysis 10.0软件对数据进行分析。

    • Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),以 0.1% 甲酸水溶液(A)-乙腈(B)为流动相进行梯度洗脱(0~3 min,5 %B;3~15 min,5 %~35 %B;15~30 min,35 %~95 %B),柱温30 °C,流速0.3 ml/min,进样量1 μl,检测波长254 nm。

    • ESI离子源,分别在正、负离子模式下采集数据,采集范围100~1700 m/z。离子源温度350 ℃,毛细管电压3.5 kV(正离子)、4.0 kV(负离子),雾化气压力45 Psi,干燥气流速11 L/min,鞘气流速11 L/min,鞘气温度350 ℃,碎片电压140 V。对照品和消痰通腑方的UHPLC-Q-TOF/MS色谱图分别见图1图2

      图  1  混合对照品的UHPLC-Q-TOF/MS色谱图

      图  2  消痰通腑方的UHPLC-Q-TOF/MS色谱图

    • 在全扫描质谱图中,大多数对照品化合物在正模式下显示[M+H]+离子,或在负模式下显示[M-H]。由于流动相中存在Na+和甲酸,部分化合物中观察到[M+Na]+和[M+HCOOH-H],少许化合物中观察到[M+K]+、[M+NH4]+及[M+CH3COOH-H]

      化合物的鉴定首先使用 Agilent 10.0软件中的按化学式查找功能,根据精确质量、同位素丰度,以及上述分子离子峰进行鉴定。当有对照品时,通过比较其在图谱上的保留时间和m/z信息与对照品的相关信息进行鉴别。在没有对照品的情况下,主要根据质谱信息(包括化合物二级质谱信息)和参考文献进行初步的鉴定。根据质谱信息和参考文献进行初步鉴定时,通过导入已建立的方剂化合物数据库,利用Agilent 10.0软件进行识别,并结合Massbank、Pubchem、Chemspider等在线数据库进行辅助分析,根据化合物准确分子量及碎片信息进行判断,排除假阳性结果。例如:

      化合物1:通过数据库识别到0.906 min的分子离子峰在正负离子模式下分别出现m/z 175.1193 的[M+H]+离子和m/z 173.1036的 [M-H] 离子,软件自动生成匹配度最高分值的分子式为C6H14N4O2,说明其可能为精氨酸。其次,结合Massbank在线数据库对其二级碎片离子进行查找,发现正离子模式下可识别到158、116碎片离子,负离子模式下可识别到173、131等碎片离子,因此,推断化合物1为精氨酸,结合我们建立化合物数据库信息,判断该化合物来源于黄连或制半夏[8]

      化合物12:通过数据库识别到1.394 min的分子离子峰在正负离子模式下分别出现m/z 333.0878的[M+H]+离子和m/z 331.0672的 [M-H] 离子,软件自动生成匹配度最高分值的分子式为C13H16O10。其次,化合物产生m/z 169没食子酸的特征碎片离子,而大黄中的简单酚酸类成分基本结构主要是没食子酸、对香豆酸、阿魏酸、对羟基苯丙酸等,因此,推测该化合物为来源于大黄的没食子酸-3-O-β-D-葡萄糖苷[9]

      化合物44:负离子模式下在17.208 min识别到m/z 837.3886的 [M-H] 离子,软件自动生成匹配度最高分值的分子式为C42H62O17。其次,化合物产生m/z 351的离子峰,为其结构中2 分子的葡萄糖醛酸苷键断裂形成的碎片离子m/z 351[2 × C6H8O6-H]离子,因此,推断化合物44为甘草皂苷G2,来源于法半夏[10]

      考虑到此中药方剂以水冲服的方式,本研究还同步分析了水提液的化学成分,结果亦参见图2表1。结果表明,70%甲醇提取物能够识别的化合物比水提液识别的化合物多10个,且化合物的峰面积也较高。与70%甲醇提取方式获得化合物相比,水提液识别的是即将吸收入血的体外化合物群的信息,而70%甲醇提取液识别的则是方剂中更多的化合物的信息,有助于解析其多成分的特征,保证消痰通腑免煎剂所含有的化合物的准确性,也有助于免煎剂生产的质量控制。

      表 1  消痰通腑方的鉴定分析结果

      序号质量相对时间(min)分子式m/z(MS1)部分特征离子峰m/z (MS2)差异(Δ ppm)名称来源药材来源文献
      1174.11150.906C6H14N4O2175.1193[M+H]+175,158,116−1.01精氨酸黄连*,制半夏[8,11]
      174.11130.906173.1036[M-H]-173,131−2.40
      2192.06170.965C7H12O6191.0552[M-H]-191,173,111−4.71奎宁酸黄连[8]
      3251.10220.996C10H13N5O3252.1093[M+H]+252,194,1370.79脱氧腺苷重楼,制半夏[11-12]
      4192.02811.189C6H8O7230.9906[M+K]+1.73柠檬酸黄连[12]
      192.02761.168191.0203[M-H]-191,111,1033.14
      5332.07671.394C13H16O10333.0878[M+H]+4.61没食子酸-3-O-β-D-葡萄糖苷大黄*[13]
      332.07461.395331.0672[M-H]-271,1690.30
      6170.02161.396C7H6O5171.0289[M+H]+171,155,1530.29没食子酸大黄*[13]
      170.02161.520169.0143[M-H]-125,1110.42
      7131.09451.508C6H13NO2132.1018[M+H]+132,86−0.76异亮氨酸天南星,制半夏[11,14]
      131.09391.475130.0869[M-H]-−3.84
      8165.0792.273C9H11NO2166.0864[M+H]+166,1200.60苯丙氨酸天南星,制半夏[11,14]
      165.07922.238164.0723[M-H]-3.66
      9354.09463.752C16H18O9353.0874[M-H]-353,191−1.13绿原酸黄连*[8]
      10204.08994.31-C11H12N2O2205.0973[M+H]+159,1460.10色氨酸黄连*,制半夏[8,11]
      204.08974.207203.0819[M-H]-142,116−0.69
      11326.10264.812C15H18O8325.0919[M-H]-325,235,1452.86对香豆酸-O-葡萄糖苷大黄[13]
      12452.13275.06-C21H24O11475.1211[M+Na]+0.00儿茶素-O-葡萄糖苷 /表儿茶素-O-葡萄糖苷大黄[13]
      452.13194.993451.1239[M-H]-451,137−1.55
      13578.1435.392C30H26O12579.1505[M+H]+0.94原花青素B2大黄*[13]
      578.14175.277577.1345[M-H]-577,289−1.23
      14290.07976.073C15H14O6291.0867[M+H]+1611.37儿茶素大黄[13]
      290.07945.995289.0721[M-H]-245,203,1871.04
      15194.05866.076C10H10O4217.0492[M+Na]+177,1454.68阿魏酸大黄[13]
      16654.19496.449C33H34O14653.1871[M-H]-653,313,169−0.774-( 4'-羟基苯基) -2-丁酮-O-阿魏酰-没食子酰-葡萄糖苷大黄[13]
      17484.08586.826C20H20O14483.078[M-H]-313,1690.00没食子酸-O-没食子酰基葡萄糖苷大黄[15]
      18164.04708.434C9H8O3163.0397[M-H]-163,155−2.45对香豆酸大黄[13]
      19564.14928.589C26H28O14565.1559[M+H]+565,5051.24夏佛托苷天南星[16]
      564.14788.556563.1418[M-H]-2.13
      20322.10938.578C19H16NO4+323.1163[M+H]+265,1893.40格兰地新黄连[17]
      21284.06878.920C16H12O5285.076[M+H]+2421.05大黄素甲醚大黄[18]
      22564.18719.192C27H32O13587.1756[M+Na]+356,3223.58鼠李糖甘草苷法半夏[16]
      23234.05339.318C12H10O5235.0604[M+H]+222,1891.282-甲基-5-羧甲基-7-羟基色原酮大黄[13]
      234.05319.262233.0458[M-H]-1.29
      24578.16419.686C27H30O14577.1554[M-H]-577,146−1.55异佛莱心苷法半夏[11]
      25442.09219.820C22H18O10443.0976[M+H]+393,1234.81表儿茶素没食子酸酯大黄[13]
      442.09019.820441.0824[M-H]-0.23
      26550.17049.845C26H18O10549.1614[M-H]-283,2390芹糖异甘草苷法半夏[10]
      27446.08569.912C21H18O11469.0733[M+Na]+279,248−1.71大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷大黄[15]
      446.08489.845445.0772[M-H]-−0.90
      28478.14719.978C23H26O11479.1551[M+H]+0.63异莲花掌苷大黄[15]
      478.14729.922477.14[M-H]-313−0.42
      29310.105810.092C15H18O7333.0949[M+Na]+1.202-O-桂皮-β-D-葡萄糖苷大黄[13]
      310.105510.002355.1035[M+HCOOH-H]-3450.00
      30234.089710.684C13H14O4235.097[M+H]+2352.132-(2′-羟丙基)-5-甲基-7-羟基色原酮大黄[13]
      234.089510.631233.0822[M-H]-1.29
      31862.195310.833C42H38O20861.1888[M-H]-699,6540.46番泻苷 B大黄[13]
      32320.089311.572C19H14NO4321.0991[M+H]+292,234−1.90黄连碱黄连[19]
      33399.166512.363C22H25NO6422.1598[M+Na]+350,336,2924.69秋水仙碱天南星[20]
      34462.116112.313C22H22O11461.1088[M-H]-461,331,169−0.22桂皮酸-O-没食子酰-葡萄糖苷大黄[9]
      35418.125713.394C21H22O9417.1188[M-H]-255,213−0.72异甘草苷法半夏[10]
      361048.543814.102C51H84O221071.5336[M+Na]+869,577−0.93重楼皂苷G重楼[21]
      1048.545714.0781047.5386[M-H]-0.48
      37408.142214.182C20H24O9431.1314[M+Na]+306,2920.236-甲氧基酸模素-8-O-β-D-葡萄糖苷大黄[13]
      408.142414.112407.1352[M-H]-0.98
      38432.105314.372C21H20O10455.0942[M+Na]+455,292−1.54芦荟大黄素-3-羟甲基-O-葡萄糖苷大黄[13]
      432.106014.317431.0989[M-H]-1.16
      391046.528314.384C51H82O221047.5356[M+H]+415,172−1.43polyphylloside III重楼[20]
      1046.528214.8521091.5286[M+HCOOH-H]-0.55
      40416.110914.554C21H20O9439.0999[M+Na]+439,336−0.23大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷大黄[13]
      416.110414.487415.1032[M-H]-−0.72
      41286.04815.273C15H10O6287.0552[M+H]+0.74木犀草素黄连*[8]
      286.048415.216285.0412[M-H]-285,215,1992.20
      42446.121315.932C22H22O10469.1104[M+Na]+469,283−0.21大黄素甲醚-8-O-β-D葡萄糖苷大黄[15]
      284.068715.865283.0616[M-H]-1.41
      43450.152317.150C22H26O10473.1413[M+Na]+473,230−1.06决明柯酮-O-乙酰基葡萄糖苷大黄[15]
      450.152817.097449.1469[M-H]-3.56
      44838.396917.208C42H62O17837.3886[M-H]-661,351−3.34甘草皂苷G2法半夏[10]
      45822.401217.943C42H62O16845.392[M+Na]+−3.17甘草酸法半夏*[10]
      822.403117.914821.3959[M-H]-351,193−0.83
      46284.032818.384C15H8O6283.0257[M-H]-2393.18大黄酸大黄[18]
      47884.477919.643C15H20O3907.4652[M+Na]+685,292−1.10纤细薯蓣皂苷重楼[21]
      884.476219.622929.4748[M+HCOOH-H]-−0.43
      48870.462219.768C44H70O17893.4502[M+Na]+376,251−0.34重楼皂苷H重楼[21]
      870.460719.622915.459[M+HCOOH-H]-−0.55
      49854.466419.773C44H70O16877.4557[M+Na]+877,306−1.31重楼皂苷II重楼[21]
      870.464619.750869.4546[M-H]-0.69
      50738.421919.932C39H62O13783.4170[M+HCOOH-H]-783,146−0.26重楼皂苷VI重楼[21]
      51270.053720.820C15H10O5269.0460[M-H]-225,1461.86芦荟大黄素大黄[18]
      52868.48222.136C45H72O16891.4746[M+Na]+725,4153.70薯蓣皂苷重楼[22]
      868.48222.104913.4809[M+HCOOH-H]-0.77
      53854.466822.323C44H70O16877.4572[M+Na]+196,1400.43重楼皂苷I重楼*[21]
      854.465522.297899.4609[M+HCOOH-H]-−1.07
      54254.057722.790C15H10O4255.0647[M+H]+196−1.96大黄酚大黄[18]
      55576.442827.329C35H60O6599.4282[M+Na]+429,3556.67胡萝卜苷天南星*[23]
      576.437427.263621.4349[M+HCOOH-H]-−2.68
      注:*表示在水提液中未检测出的化合物

      通过上述分析方法得到55种化合物,其中,精氨酸、奎宁酸、柠檬酸、黄连碱、格兰地新、绿原酸、木犀草素、色氨酸共8个化合物来自黄连;脱氧腺苷、薯蓣皂苷、重楼皂苷G、polyphylloside III、重楼皂苷II、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷H、重楼皂苷VI、重楼皂苷I共9个化合物来自重楼;异亮氨酸、苯丙氨酸、夏佛托苷、秋水仙碱、胡萝卜苷共5个化合物来自天南星;精氨酸、脱氧腺苷、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、鼠李糖甘草苷、异佛莱心苷、芹糖异甘草苷、异甘草苷、甘草皂苷G2、甘草酸共10个化合物来自法半夏;没食子酸-3-O-β-D-葡萄糖苷、没食子酸、对香豆酸-O-葡萄糖苷、儿茶素-O-葡萄糖苷/表儿茶素-O-葡萄糖苷、原花青素B2、儿茶素、阿魏酸、4-( 4'-羟基苯基) -2-丁酮-O-阿魏酰-没食子酰-葡萄糖苷、没食子酸-O-没食子酰基葡萄糖苷、对香豆酸、大黄素甲醚、2-甲基-5-羧甲基-7-羟基色原酮、表儿茶素没食子酸酯、大黄酸-8-O-葡萄糖苷、异莲花掌苷、2-O-桂皮-β-D-葡萄糖苷、2-(2'-羟丙基)-5-甲基-7-羟基色原酮、番泻苷B、桂皮酸-O-没食子酰-葡萄糖苷、6-甲氧基酸模素-8-O-β-D-葡萄糖苷、芦荟大黄素-3-羟甲基-O-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-D葡萄糖苷、决明柯酮-O-乙酰基葡萄糖苷、大黄酸、芦荟大黄素、大黄酚共27个化合物来自生大黄或制大黄具体参见表1。其中,部分化合物例如精氨酸、脱氧腺苷、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸是根茎类化合物的共有化学成分,在黄连、重楼及半夏中均可以检测到,因此,根据化合物的文献检索进行了相应的归属。

    • 中药方剂在中医临床实践中形成了以汤剂为主的口服给药方式,药材煎煮制备获得复方时是否会导致化学成分的改变,消痰通腑方免煎剂是否也需要对上述化合物进行检测来确定方剂的质量均未知。再有,中药方剂具有多成分、多靶点、多途径、整合调节的作用特点,因此,有必要对消痰通腑方所含所有药材的化学成分群进行分析,初步确定其化学成分特征,为后期研究和临床应用提供数据参考。

      为了实现化合物的高效、快速提取,首先考察了不同的超声提取溶剂(水、70%及100%甲醇溶液)、提取时间(30、45 和60 min)、样品与溶剂的比例(1:5、1:10和1:20),结果表明,以10倍溶剂即50 ml的75%甲醇溶液超声提取30 min为最佳样品制备方法。为了获得分离效果好、总离子流强的色谱图,选择了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水(含0.1%甲酸)和乙腈-水(含0.1%甲酸)流动相体系进行分析。结果表明,乙腈-0.1%甲酸水溶液组成的流动相在正、负离子扫描模式下均表现出良好的分离效果和丰富的信号响应。除此以外,本研究还考察了不同流速(0.3、0.4 和0.5 ml/min)和不同柱温(25、30 和35 ℃)对于分析效果的影响。结果显示,当柱温在30 °C,流速为0.3 ml/min时,色谱峰峰形尖锐、色谱图基线稳定,柱压平稳。

      本研究采用的分析方法具有快捷、简便、易行,样品用量小和高通量等特点,且样品前处理简单,所建立的方法可用于快速鉴别消痰通腑方免煎剂的化学成分。所鉴定的化合物中包括多数具有抗炎抗肿瘤等活性的化合物。例如,已有文献表明,重楼皂苷类成分如重楼皂苷I可以通过诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖和转移等发挥抗肿瘤作用[24-25];天南星中的夏佛托苷可以通过诱导自噬激活发挥抗肿瘤细胞增殖作用[26];黄连碱作为黄连中的主要成分之一,具有抗真菌、胃黏膜保护、细胞毒等一些药理活性[27];含大黄的方剂具有辅助放、化疗增敏减毒的功效,所含化合物大黄酸、大黄素甲醚在抗炎、抗肿瘤等方面都具有显著效果[28]

      综上,本研究基于UHPLC-Q-TOF/MS技术开展消痰通腑方免煎剂中的化学成分分析,丰富了全方的物质基础研究,为进一步明确其质量控制标志物和药效物质研究提供了科学依据。

参考文献 (28)

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