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总状共头霉CGMCC 3.2500对积雪草酸的生物转化

李慧 王晶 顾申勇

李慧, 王晶, 顾申勇. 总状共头霉CGMCC 3.2500对积雪草酸的生物转化[J]. 药学实践与服务, 2021, 39(4): 336-339. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202012005
引用本文: 李慧, 王晶, 顾申勇. 总状共头霉CGMCC 3.2500对积雪草酸的生物转化[J]. 药学实践与服务, 2021, 39(4): 336-339. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202012005
LI Hui, WANG Jing, GU Shenyong. Microbial transformation of Asiatic acid by Syncephalastrum racemosum CGMCC 3.2500[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2021, 39(4): 336-339. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202012005
Citation: LI Hui, WANG Jing, GU Shenyong. Microbial transformation of Asiatic acid by Syncephalastrum racemosum CGMCC 3.2500[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2021, 39(4): 336-339. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202012005

总状共头霉CGMCC 3.2500对积雪草酸的生物转化

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202012005
基金项目: 上海市青浦区卫健委资助项目(W2018-02)
详细信息
    作者简介:

    李 慧,硕士,主管药师,研究方向:临床药学,Email:penguinhui@126.com

    通讯作者: 顾申勇,硕士,副主任药师,研究方向:临床药学,Email:gusy5555@163.com
  • 中图分类号: R914

Microbial transformation of Asiatic acid by Syncephalastrum racemosum CGMCC 3.2500

  • 摘要:   目的  积雪草酸是积雪草中的主要药用成分,为乌苏烷型三萜化合物,具有多种生物活性,通过对其进行结构修饰,以获得活性更好的积雪草酸类似物。  方法  使用总状共头霉CGMCC 3.2500对积雪草酸进行生物转化,通过高分辨质谱(HR-ESI-MS)、核磁共振波谱(包括1H NMR、13C NMR、1H-13C HSQC、1H-13C HMBC、1H-1H NOESY)鉴定其结构。  结果  获得一个化合物,最终确定化合物的结构为2-氧-3α, 15α, 23-三羟基-12-烯-28-油酸,该化合物为新化合物。  结论  总状共头霉CGMCC 3.2500能够对积雪草酸进行结构修饰,获得积雪草酸类似物。
  • 图  1  化合物1的HSQC谱图

    图  2  化合物1的HMBC谱图

    图  3  化合物1的NOESY 图

    图  4  2-氧-3α,15α, 23-三羟基-12-烯-28-油酸结构式

    表  1  化合物1的NMR数据

    位点CHHMBC
    154.412.58 (d, 12.0); 2.31 (o)2, 3, 5, 10, 25
    2213.29/
    378.145.08 (s)2, 23, 24, 4
    450.42/
    546.732.53 (d, 10.8)4, 10, 7, 25, 24
    619.481.87 (m), 1.97 (m)
    736.522.46 (m); 2.33 (o)
    842.19/
    948.222.12 (m)1, 14, 8, 26
    1044.13/
    1124.291.92 (t, 4.2); 1.96 (m)8, 9, 13, 12
    12127.045.61 (t, 3.6)14
    13140.86/
    1449.18/
    1568.124.93 (dd, 9.6, 6.6)
    1636.832.45 (m); 2.44 (m)15, 18, 17, 28
    1747.89/
    1854.702.64 (d, 11.4)28, 13, 12, 17, 19, 22, 29
    1939.921.57 (m)
    2039.711.55 (m)
    2131.491.44 (m); 1.38 (s)
    2237.551.98 (m); 1.99 (m)17, 20, 21, 28
    2365.384.06 (d, 11.4); 3.77 (d, 11.4)3, 4, 5
    2414.430.82 (s)3, 23, 4, 5
    2518.140.98 (s)1, 5, 10
    2617.911.18 (s)14, 8, 7
    2718.171.47 (s)13, 15, 14, 8
    28180.36/
    2917.781.03 (d, 6.6)19, 20
    3021.790.92 (d, 6.0)20, 21
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-12-03
  • 修回日期:  2021-06-26
  • 网络出版日期:  2021-07-21
  • 刊出日期:  2021-07-25

总状共头霉CGMCC 3.2500对积雪草酸的生物转化

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202012005
    基金项目:  上海市青浦区卫健委资助项目(W2018-02)
    作者简介:

    李 慧,硕士,主管药师,研究方向:临床药学,Email:penguinhui@126.com

    通讯作者: 顾申勇,硕士,副主任药师,研究方向:临床药学,Email:gusy5555@163.com
  • 中图分类号: R914

摘要:   目的  积雪草酸是积雪草中的主要药用成分,为乌苏烷型三萜化合物,具有多种生物活性,通过对其进行结构修饰,以获得活性更好的积雪草酸类似物。  方法  使用总状共头霉CGMCC 3.2500对积雪草酸进行生物转化,通过高分辨质谱(HR-ESI-MS)、核磁共振波谱(包括1H NMR、13C NMR、1H-13C HSQC、1H-13C HMBC、1H-1H NOESY)鉴定其结构。  结果  获得一个化合物,最终确定化合物的结构为2-氧-3α, 15α, 23-三羟基-12-烯-28-油酸,该化合物为新化合物。  结论  总状共头霉CGMCC 3.2500能够对积雪草酸进行结构修饰,获得积雪草酸类似物。

English Abstract

李慧, 王晶, 顾申勇. 总状共头霉CGMCC 3.2500对积雪草酸的生物转化[J]. 药学实践与服务, 2021, 39(4): 336-339. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202012005
引用本文: 李慧, 王晶, 顾申勇. 总状共头霉CGMCC 3.2500对积雪草酸的生物转化[J]. 药学实践与服务, 2021, 39(4): 336-339. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202012005
LI Hui, WANG Jing, GU Shenyong. Microbial transformation of Asiatic acid by Syncephalastrum racemosum CGMCC 3.2500[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2021, 39(4): 336-339. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202012005
Citation: LI Hui, WANG Jing, GU Shenyong. Microbial transformation of Asiatic acid by Syncephalastrum racemosum CGMCC 3.2500[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2021, 39(4): 336-339. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202012005
  • 积雪草酸,是一种乌苏烷型三萜化合物,是积雪草中的主要药用成分,具有保肝、抗肿瘤、改善认知、降血糖、抗炎、抗菌、护肤等药理作用[1-2]。但是积雪草酸溶解度小,口服生物利用度低,较难通过血脑屏障,使得积雪草酸的使用受到一定限制,已有研究人员对积雪草酸进行了多种化学修饰,获得了一系列不同特性的积雪草酸衍生物[1-5]。由于积雪草酸结构的特殊性,化学修饰位点较少,生物修饰是对天然药物进行结构修饰的重要方法,已有研究报道通过微生物对积雪草酸进行生物修饰[6-8]。本实验通过总状共头霉CGMCC 3.2500对积雪草酸进行结构修饰,采用高分辨质谱(HR-ESI-MS)以及多种核磁共振(NMR)波谱:氢谱(1H NMR)、碳谱(13C NMR)、1H-13C异核单量子相干谱(1H-13C HSQC)、1H-13C异核多键相关谱(1H-13C HMBC)、1H-1H 核Overhauser效应谱(1H-1H NOESY)等技术对其结构进行确证,获得了一个新的化合物,为积雪草酸的应用与开发提供参考依据。

    • 总状共头霉CGMCC 3.2500(中国普通微生物菌种保藏管理中心),4 ℃斜面保藏。

    • 马铃薯培养基(PDA):将200 g马铃薯去皮切块置于1000 ml蒸馏水中,煮沸1 h,用纱布过滤,加葡萄糖20.0 g,琼脂15.0 g,将滤液补足至1.0 L,分装,121 ℃、30 min灭菌后,将试管倾斜放置,冷凝后即得固体马铃薯培养基。液体培养基的制备不加琼脂,其余步骤同上。

    • DRX-600光谱仪(德国Rheinstetten公司);Agilent 6538 VAD Accurate-Mass QTOF液质联用系统(美国安捷伦);Agilent 1260高效液相色谱仪(含G1311C 1260 VL型四元泵、G1316A 1260柱温箱、G1315D 1260 VL型全波长扫描检测器、G1364C 1260 FC-AS,美国安捷伦),ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱;氘代吡啶(剑桥同位素实验室);积雪草酸(广西昌洲天然药业有限公司)。

    • 将已经恢复培养的菌种接种至无菌的250 ml三角瓶(装有100 ml液体培养基)中,180 r/min、27 ℃下震荡培养72 h后取出,每瓶加入500 μl的积雪草酸乙醇溶液(4 mg/ml),相同条件继续培养10 d。设两组对照,一组接种微生物后只加入等体积的乙醇溶液(无底物);另一组加入等量的底物到空白培养基中,在相同条件下培养。发酵完成后过滤菌丝体,滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3次,菌丝体用500 ml乙酸乙酯超声提取3次,每次30 min,合并乙酸乙酯萃取液及提取液,在60 ℃下真空浓缩至小体积,薄层色谱法(TLC)比较实验组与空白组的显色斑点,以氯仿/甲醇(9∶1)为展开剂,10%的硫酸乙醇溶液显色。

    • 在10个1000 ml三角瓶中(每瓶装有400 ml培养基)以2%的接种量接入已恢复培养的总状共头霉CGMCC 3.2500菌种,置恒温振荡器中,180 r/min、27 ℃培养72 h后加入200.0 mg底物积雪草酸(溶于20 ml乙醇,每瓶加入2 ml),继续培养10 d。发酵完成后过滤菌丝体,滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3次,将乙酸乙酯萃取液置旋转蒸发仪上浓缩至小体积,干燥,分别获得转化反应提取物0.4 g;转化反应提取物经凝胶柱纯化后,用半制备型高效液相色谱仪制备,流动相:甲醇/水/甲酸(60:40:0.05,V/V/V),流速3 ml/min,检测波长:210 nm,得到化合物1(10.5 mg,转化率5.25%)。

    • 化合物1为白色固体粉末,高分辨质谱显示出[M-H]-分子离子峰m/z 501.3240,结合1H NMR谱和13C NMR谱推断确定分子式为C30H46O61H NMR(600 MHz, pyridine-d5)中,高场处有6组甲基氢信号δ 1.47 (3H, s)、δ 1.18 (3H, s)、δ 1.03 (3H, d, 6.6)、δ 0.98 (3H, s)、δ 0.92 (3H, d, 6.0)、δ 0.82 (3H, s);低场处有一活泼氢信号:δ 5.61 (t, 3.6),推测为双键上的氢。13C NMR谱检测结果显示两个不饱和碳原子δ 127.04和δ 140.86,一个羧基碳原子δ 180.36,一个羰基碳原子δ 213.29,综合以上信息可以推断该化合物为乌苏烷型五环三萜酸类化合物。

      依据1H-13C HSQC谱(图1)、1H-13C HMBC谱(图2)可以对该化合物的碳氢作进一步的归属。

      图  1  化合物1的HSQC谱图

      图  2  化合物1的HMBC谱图

      与底物积雪草酸比较,在13C NMR谱中,213.29 ppm出现一个羰基碳信号,该羰基碳与H-1 (δ 2.58, d, 12.0)、H-3 (δ 5.08, s) 远程相关,说明C-2位的羟基被氧化成羰基。H-3 (δ 5.08, s)和C-3 (δ 78.14)的化学位移未发生显著变化,但是在1H-1H NOESY(图3)中,可以观察到H-3 (δ 5.08, s)和H-24 (δ 0.82)之间的NOE效应,说明3位的羟基构型发生了变化,由β构型转变为α构型。

      图  3  化合物1的NOESY 图

      13C NMR谱中,68.12 ppm处出现一个连氧碳信号,在1H NMR谱中,4.93 ppm(1H, dd, J=6.6, 9.6 Hz) 出现一个氢原子信号,二者在1H-13C HSQC谱中可观察到相关信号。在1H-13C HMBC谱中,可观察到H-27 (δ 1.47, s)、H-16 (δ 2.45, m)和δ 68.12的相关信号,说明15位发生了羟基化反应。同时H-15ax与H-16ax的耦合常数为9.6 Hz,确定该羟基为α型。

      具体的1H NMR 和13C NMR 数据及归属见表1

      表 1  化合物1的NMR数据

      位点CHHMBC
      154.412.58 (d, 12.0); 2.31 (o)2, 3, 5, 10, 25
      2213.29/
      378.145.08 (s)2, 23, 24, 4
      450.42/
      546.732.53 (d, 10.8)4, 10, 7, 25, 24
      619.481.87 (m), 1.97 (m)
      736.522.46 (m); 2.33 (o)
      842.19/
      948.222.12 (m)1, 14, 8, 26
      1044.13/
      1124.291.92 (t, 4.2); 1.96 (m)8, 9, 13, 12
      12127.045.61 (t, 3.6)14
      13140.86/
      1449.18/
      1568.124.93 (dd, 9.6, 6.6)
      1636.832.45 (m); 2.44 (m)15, 18, 17, 28
      1747.89/
      1854.702.64 (d, 11.4)28, 13, 12, 17, 19, 22, 29
      1939.921.57 (m)
      2039.711.55 (m)
      2131.491.44 (m); 1.38 (s)
      2237.551.98 (m); 1.99 (m)17, 20, 21, 28
      2365.384.06 (d, 11.4); 3.77 (d, 11.4)3, 4, 5
      2414.430.82 (s)3, 23, 4, 5
      2518.140.98 (s)1, 5, 10
      2617.911.18 (s)14, 8, 7
      2718.171.47 (s)13, 15, 14, 8
      28180.36/
      2917.781.03 (d, 6.6)19, 20
      3021.790.92 (d, 6.0)20, 21

      综上,化合物1的结构确定为2-氧-3α,15α, 23-三羟基-12-烯-28-油酸(图4)。经文献检索,未发现与该化合物结构相同的报道,确定该化合物为新化合物。

      图  4  2-氧-3α,15α, 23-三羟基-12-烯-28-油酸结构式

    • 积雪草酸是中药积雪草中的主要有效成分,具有多种生物活性[9]。微生物转化具有专一性强、条件温和等优点[10]。本研究通过总状共头霉CGMCC 3.2500对积雪草酸的生物转化,获得一个新化合物:2-氧-3α15α, 23-三羟基-12-烯-28-油酸。从催化反应的位置看,2位的羟基发生氧化生成了羰基,3位的羟基的立体结构由β变成α,15位发生羟基化反应。这些结构的变化由化学反应很难实现,也体现了生物转化高度的位置选择性和立体选择性。化合物1的转化率为5.25%,需要进一步优化转化条件,以提高转化效率。

参考文献 (10)

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