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水母胶原蛋白的提取及性能研究

仇雷雷 王博 邹帅军 王倩倩 张黎明

仇雷雷, 王博, 邹帅军, 王倩倩, 张黎明. 水母胶原蛋白的提取及性能研究[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(6): 509-515. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202008078
引用本文: 仇雷雷, 王博, 邹帅军, 王倩倩, 张黎明. 水母胶原蛋白的提取及性能研究[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(6): 509-515. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202008078
QIU Leilei, WANG Bo, ZOU Shuaijun, WANG Qianqian, ZHANG Liming. Isolation and characterization of collagen from the jellyfish Nemopilema nomurai[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(6): 509-515. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202008078
Citation: QIU Leilei, WANG Bo, ZOU Shuaijun, WANG Qianqian, ZHANG Liming. Isolation and characterization of collagen from the jellyfish Nemopilema nomurai[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(6): 509-515. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202008078

水母胶原蛋白的提取及性能研究

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202008078
基金项目: 国家自然科学基金项目(81974496)
详细信息
    作者简介:

    仇雷雷,硕士研究生,研究方向:海洋生物活性物质,Email:qiuleileismmu@163.com

    通讯作者: 王倩倩,博士,副研究员,研究方向:海洋生物活性物质,Email:abc_w@163.com张黎明,教授,博士生导师,研究方向:海洋生物活性物质及海洋生物伤防治,Email:lmzhang@smmu.edu.cn
  • 中图分类号: R94

Isolation and characterization of collagen from the jellyfish Nemopilema nomurai

  • 摘要:   目的  优化越前水母(Nemopilema nomurai)胶原蛋白提取工艺,并探究其性能。  方法  利用乙酸和胃蛋白酶提取胶原蛋白,通过盐析和超滤纯化水母胶原蛋白粗提物,并对水母胶原蛋白进行表征和性能分析。  结果  水母胶原蛋白纯度97%,得率33%(干重);X射线衍射、紫外光谱和傅里叶变换红外光谱检测结果表明,水母胶原蛋白在提取和纯化过程中保持了胶原蛋白三螺旋结构;氨基酸组成和凝胶电泳分析提示,水母胶原蛋白符合Ⅰ型胶原蛋白特征。溶解度实验表明,水母胶原蛋白在pH 3~5,NaCl浓度小于0.9 mol/L的条件下都具有良好的溶解性。  结论  所得水母胶原蛋白与牛Ⅰ型胶原蛋白特征相似,有望成为新的胶原蛋白资源。
  • 图  1  水母胶原蛋白提取的单因素分析

    A.加酶量;B.乙酸浓度C.料液比;D.提取时间

    图  2  水母胶原蛋白纯化过程SDS-PAGE电泳图

    M.蛋白Marker;1~2.分子量分别是5万、10万透析袋处理;3~5.分别是0.9 mol/L→0.9 mol/L→0.9 mol/L、0.9 mol/L→0.9 mol/L→2.0 mol/L、2.0 mol/L→0.9 mol/L→0.9 mol/L NaCl的盐析处理;6~7.分子量分别是10万和5万的超滤处理;8.水母胶原蛋白粗提物

    图  3  纯化后水母胶原蛋白SDS-PAGE电泳图

    m.蛋白Marker;a.纯化后的水母胶原蛋白;b.牛胶原蛋白

    图  4  胶原蛋白的X射线衍射图谱

    a.牛胶原蛋白;b.水母胶原蛋白

    图  5  胶原蛋白紫外光谱

    a.牛胶原蛋白;b.水母胶原蛋白

    图  6  胶原蛋白的红外光谱

    A.水母胶原蛋白;B.牛胶原蛋白

    图  7  水母胶原蛋白在不同pH值及NaCl浓度条件下溶解度特性

    A.NaCl浓度对溶解度的影响;B.pH值对溶解度的影响

    表  1  水母胶原蛋白提取正交实验因素水平表

    水平因素
    A加酶量(%)B乙酸浓度(mol/L)C料液比D反应时间(h)
    10.10.31∶124
    20.20.41∶248
    30.30.51∶372
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    表  2  水母胶原蛋白提取正交实验结果

    水平因素
    A 加酶量(%)B 乙酸浓度(mol/L)C料液比(g/ml)D时间(h)胶原蛋白得率(%)
    实验10.10.31∶12417.8±0.66
    实验20.10.41∶24823.2±0.94
    实验30.10.51∶37221.7±0.85
    实验40.20.31∶27226.7±0.58
    实验50.20.41∶32419.0±0.86
    实验60.20.51∶14824.2±0.76
    实验70.30.31∶34826.9±0.61
    实验80.30.41∶17231.1±0.50
    实验90.30.51∶22424.3±0.75
    K120.923.824.320.4
    K223.324.424.724.8
    K327.423.422.526.5
    R6.531.032.20 6.13
    因素主次A>D>C>B
    最佳组合A3B2C2D3
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    表  3  胶原蛋白X射线衍射峰对应的d

    组别衍射峰2θ/(°)d值(nm)
    水母胶原蛋白峰1 7.11.244
    峰221.30.418
    峰330.20.295
    牛胶原蛋白峰1 7.21.226
    峰220.30.437
    峰330.10.296
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    表  4  二种胶原蛋白中不同氨基酸组分的百分比

    氨基酸名称氨基酸占比(%)
    水母胶原蛋白牛胶原蛋白
    天冬氨酸Asp7.834.57
    苏氨酸Thr3.551.73
    丝氨酸Ser4.893.19
    谷氨酸Glu9.987.27
    甘氨酸Gly34.8234.37
    丙氨酸Ala8.3612.46
    缬氨酸Val2.742.27
    蛋氨酸Met0.210.01
    异亮氨酸Ile1.881.22
    亮氨酸Leu3.092.64
    酪氨酸Tyr0.110.27
    苯丙氨酸Phe0.91.38
    赖氨酸Lys2.962.15
    组氨酸His0.290.48
    精氨酸Arg3.875.3
    脯氨酸Pro8.1612.43
    羟脯氨酸Hyp6.338.26
    合计100100
    注:氨基酸分析采用氨基酸残基数占100个氨基酸残基的比例
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-08-19
  • 修回日期:  2020-10-16
  • 刊出日期:  2020-11-25

水母胶原蛋白的提取及性能研究

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202008078
    基金项目:  国家自然科学基金项目(81974496)
    作者简介:

    仇雷雷,硕士研究生,研究方向:海洋生物活性物质,Email:qiuleileismmu@163.com

    通讯作者: 王倩倩,博士,副研究员,研究方向:海洋生物活性物质,Email:abc_w@163.com张黎明,教授,博士生导师,研究方向:海洋生物活性物质及海洋生物伤防治,Email:lmzhang@smmu.edu.cn
  • 中图分类号: R94

摘要:   目的  优化越前水母(Nemopilema nomurai)胶原蛋白提取工艺,并探究其性能。  方法  利用乙酸和胃蛋白酶提取胶原蛋白,通过盐析和超滤纯化水母胶原蛋白粗提物,并对水母胶原蛋白进行表征和性能分析。  结果  水母胶原蛋白纯度97%,得率33%(干重);X射线衍射、紫外光谱和傅里叶变换红外光谱检测结果表明,水母胶原蛋白在提取和纯化过程中保持了胶原蛋白三螺旋结构;氨基酸组成和凝胶电泳分析提示,水母胶原蛋白符合Ⅰ型胶原蛋白特征。溶解度实验表明,水母胶原蛋白在pH 3~5,NaCl浓度小于0.9 mol/L的条件下都具有良好的溶解性。  结论  所得水母胶原蛋白与牛Ⅰ型胶原蛋白特征相似,有望成为新的胶原蛋白资源。

English Abstract

仇雷雷, 王博, 邹帅军, 王倩倩, 张黎明. 水母胶原蛋白的提取及性能研究[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(6): 509-515. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202008078
引用本文: 仇雷雷, 王博, 邹帅军, 王倩倩, 张黎明. 水母胶原蛋白的提取及性能研究[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(6): 509-515. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202008078
QIU Leilei, WANG Bo, ZOU Shuaijun, WANG Qianqian, ZHANG Liming. Isolation and characterization of collagen from the jellyfish Nemopilema nomurai[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(6): 509-515. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202008078
Citation: QIU Leilei, WANG Bo, ZOU Shuaijun, WANG Qianqian, ZHANG Liming. Isolation and characterization of collagen from the jellyfish Nemopilema nomurai[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(6): 509-515. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202008078
    • 胶原蛋白主要存在于动物皮肤、骨骼和结缔组织中,是主要的结构蛋白质。胶原蛋白具有较低的免疫原性、较好的生物相容性、良好的生物降解性等生物学优点,广泛应用于生物制药、医疗保健、组织工程、食品加工、美容化妆品等领域。目前胶原蛋白主要来源于陆生牲畜(牛、羊和猪等),但某些疾病(口蹄疫、疯牛病)以及宗教相关问题,使得这些牲畜来源的胶原蛋白应用受到一定约束[1]。海洋来源的胶原蛋白资源丰富,且不存在传染性病菌和伦理等问题,因而,对海洋生物来源的胶原蛋白进行开发利用具有良好的应用前景[2]

      目前,从海洋生物提取胶原蛋白的研究主要集中在鳕鱼、罗非鱼、海参以及水母等,这些海洋生物的皮肤、肌肉、软骨组织及中胶层等部位中含有丰富的胶原蛋白[3]。水母是一类胶质状的浮游生物,属刺胞动物门,种类多,分布广,我国近海海域水母资源丰富。大型水母伞部直径可达2 m,中胶层非常厚实,其中胶原蛋白(122.64~693.92 mg/g,干重)约占总蛋白含量的50%[4]。本研究选用青岛海域采集的越前水母(Nemopilema nomurai),对其伞部胶原蛋白进行分离纯化和表征,为水母胶原蛋白的开发应用提供理论基础。

    • SCIENTZ-12N冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司);LA8080氨基酸自动分析仪(日本株式会社日立高新技术科学);Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪(美国Thermo Scientific公司);X′Pert3 Powder X射线衍射仪(荷兰帕纳科公司);VARIOSKAN LUX多功能酶标仪(美国Thermo Scientific公司);Mini-PROTEAN Tetra System垂直电泳系统(美国BIO-RAD公司)。

    • 越前水母样品采集于青岛海域,腌制后于−20 ℃保存;牛I型胶原蛋白标准品(河北考力森公司);胃蛋白酶(上海生工生物工程公司);标准蛋白Marker(日本TaKaRa公司);其余试剂均为国产分析纯。

    • 提取:经腌制的水母样品用自来水清洗,去除表面盐分,4 ℃下用去离子水浸泡、洗净后,再用异丙醇去除脂肪、NaOH去除杂蛋白、过氧化氢去除色素。称取去杂水母伞盖样品,组织匀浆后加入相应体积不同浓度(0.3~0.6 mol/L)的乙酸溶液,胃蛋白酶的添加量为水母伞盖质量的0.1%~0.5%,酶消化时间为24~96 h,反应后的液体使用200目网过滤,离心(4 ℃,10000 r/min)30 min取上清即得粗提液。

      纯化:①超滤:分别取粗提液5 ml至分子量10万和5万的超滤管中,4 ℃离心(4000 r/min,30 min),收集滤液进行SDS-PAGE分析。②透析:分别取粗提液5 ml到分子量5万和10万的透析袋中,4 ℃透析3 d,每8 h换一次透析液,取样进行电泳分析。③盐析:取粗提液5 ml,添加NaCl至浓度为0.9 mol/L,4 ℃下10000 r/min离心10 min,收集沉淀,复溶于0.5 mol/L乙酸溶液,重复上述过程2次,取溶液进行电泳分析。仅改变NaCl浓度(0.9 mol/L→0.9 mol/L→2.0 mol/L或2.0 mol/L→0.9 mol/L→0.9 mol/L),重复实验。

      粗提液纯化后,在−80 ℃冷冻干燥得水母酶溶性胶原蛋白(PSC)。

    • 以水母胶原蛋白得率(冻干胶原蛋白质量/水母干重)为指标,确定基本反应条件(乙酸浓度、料液比、胃蛋白酶用量、提取时间),每次改变其中一个条件进行水母胶原蛋白提取的单因素实验。

      获得单因素数据后,设计正交实验(表1)来获取最佳的实验方案。

      表 1  水母胶原蛋白提取正交实验因素水平表

      水平因素
      A加酶量(%)B乙酸浓度(mol/L)C料液比D反应时间(h)
      10.10.31∶124
      20.20.41∶248
      30.30.51∶372
    • 参照Coentro等[5]的方法检测胶原蛋白浓度,将100 μl胶原蛋白溶液添加至1 ml天狼星红色染料中静置30 min,然后以12000 r/min离心30 min。去除上清,沉淀用碱性试剂溶解30 min,取200 μl胶原蛋白液于540 nm处读数。

    • 用X射线衍射仪分析胶原蛋白样品的晶体结构,X射线源为Cu靶Ka辐射(λ=0.154 nm),电流为40 mA,电压为40 kV。扫描角度2θ为5°~40°,扫描速率为3.6°/min,并根据公式λ=2d sinθ,计算d值。

    • 胶原蛋白溶解于0.5 mol/L乙酸中,用多功能酶标仪检测其紫外光谱。扫描波段为200~400 nm,波长间隔为1 nm。以0.5 mol/L乙酸溶液作为空白对照。

    • 取胶原蛋白5 mg和适量KBr置于研钵中,研磨均匀。取适量的混合样品于压片磨具中,用压片机制成试样薄片。将压片放入傅里叶变换红外光谱仪内进行扫描(500~4000 cm−1,分辨率2 cm−1)。

    • 胶原蛋白溶液和上样缓冲液混匀后水浴(100 ℃)加热5 min,取15 μl上样,使用8%的分离胶和5%的浓缩胶,80 V电泳100 min。

    • 胶原蛋白样品在110 ℃下盐酸水解24 h,水解产物12000 r/min离心20 min,上清液用氨基酸自动分析仪进行氨基酸含量测定。

    • 将胶原蛋白样品溶于0.5 mol/L乙酸溶液中,配成1 mg/ml的胶原蛋白溶液,分别取10 ml溶液调配成不同pH值(3~9共7个梯度)和NaCl浓度(0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 mol/L),10000 r/min离心,取上清液进行胶原蛋白浓度测定,并绘制变化曲线。

    • 数据采用($\bar x $±s)表示,用 GraphPad Prism 8.0.2作图并对各组进行方差分析,两组间比较采用t检验。检验水准α=0.05,P<0.05有统计学意义。

    • 图1A可见,当酶的用量从0.1%升到0.3%时,胶原蛋白得率逐渐增高并达到最大值。继续增加酶使用量,胶原蛋白得率反而减少,可能是过量酶对胶原蛋白具有一定破坏作用。从图1B可见,当乙酸浓度为0.4 mol/L时,胶原蛋白的得率最高。而乙酸过量,会破坏已生成胶原蛋白。从图1C可见,料液比在1∶2 g/ml时,水母胶原蛋白的得率最大。可能是料液比低于1∶2 g/ml时,胶原溶胀不充分,而料液比继续增加并没有多余胶原以供溶胀。从图1D可见,随着时间推移,胶原蛋白的得率先升高再下降:48 h和24 h相比,增加了8.8%;72 h和48 h相比,增加了15.9%;96 h和72 h相比,得率反而下降,说明72 h是胶原蛋白提取的最佳时间点。

      图  1  水母胶原蛋白提取的单因素分析

    • 表2正交实验极差R分析中,RA>RD>RC>RB,即在胶原蛋白提取中,酶的使用量起着最关键的作用,提取时间排第二,料液比和乙酸浓度的影响比较小。综合这9组数据,确定最优理论水平为A3B2C2D3,即乙酸(0.4 mol/L)、料液比(1∶2 g/ml)、胃蛋白酶(0.3%),提取72 h,此时的得率为(33±0.63)%。

      表 2  水母胶原蛋白提取正交实验结果

      水平因素
      A 加酶量(%)B 乙酸浓度(mol/L)C料液比(g/ml)D时间(h)胶原蛋白得率(%)
      实验10.10.31∶12417.8±0.66
      实验20.10.41∶24823.2±0.94
      实验30.10.51∶37221.7±0.85
      实验40.20.31∶27226.7±0.58
      实验50.20.41∶32419.0±0.86
      实验60.20.51∶14824.2±0.76
      实验70.30.31∶34826.9±0.61
      实验80.30.41∶17231.1±0.50
      实验90.30.51∶22424.3±0.75
      K120.923.824.320.4
      K223.324.424.724.8
      K327.423.422.526.5
      R6.531.032.20 6.13
      因素主次A>D>C>B
      最佳组合A3B2C2D3
    • 图2中水母胶原蛋白粗提物(泳道8)在分子量13万处含有大量的目标胶原蛋白,分子量10万以下有杂条带。不同规格透析袋处理(泳道1、2)后,分子量10万以下的杂蛋白部分去除;盐析结果显示,0.9 mol/L→0.9 mol/L→2.0 mol/L NaCl的盐析(泳道4)可以去除大量杂蛋白,但目标蛋白损失较多,而0.9 mol/L→0.9 mol/L→0.9 mol/L NaCl(泳道3)处理既可以保留目标蛋白又能够去除部分杂蛋白。最后超滤结果显示,分子量10万(泳道6)的超滤管可以明显减少杂蛋白含量。

      图  2  水母胶原蛋白纯化过程SDS-PAGE电泳图

    • 纯化实验结果提示,单一纯化方法不能完全去除杂蛋白,传统透析处理耗时长,而反复盐析会增加胶原蛋白溶液NaCl含量。综合权衡后确定纯化条件为0.9 mol/L→0.9 mol/L→0.9 mol/L NaCl盐析和100 kDa超滤组合。图3是组合纯化后胶原蛋白电泳图:泳道b为牛I型胶原蛋白标准品,在分子量13万左右有α1、α2链,而β链γ链的分子量都在20万以上。本实验提取的水母胶原蛋白(泳道a),分子量10万下基本没有杂蛋白,但α链只发现了一条,其分子可能是(α1)3[6-7],分子量在13万左右,符合I型胶原蛋白的特征。

      图  3  纯化后水母胶原蛋白SDS-PAGE电泳图

    • 胶原蛋白X射线衍射分析结果如图4表3所示。水母胶原蛋白和牛胶原蛋白都有3个衍射峰。峰1形状尖锐与胶原蛋白三螺旋结构有关,d值反映胶原蛋白分子链间距离[8],水母和牛胶原蛋白的d1值分别为1.244 nm和1.226 nm。在20°附近出现一个宽大峰(峰2),代表胶原蛋白纤维内部众多结构层次所引起的漫散射[9]。在30°附近出现了第3个峰(峰3),该峰较小,其d值显示三股螺旋结构中沿螺旋中心轴相邻氨基酸残基之间的距离[10],水母和牛胶原蛋白峰3的d3值分别为0.295 nm和0.296 nm,极为接近。说明水母胶原蛋白和牛胶原蛋白标准品一样,保持了完整的三股螺旋结构。

      表 3  胶原蛋白X射线衍射峰对应的d

      组别衍射峰2θ/(°)d值(nm)
      水母胶原蛋白峰1 7.11.244
      峰221.30.418
      峰330.20.295
      牛胶原蛋白峰1 7.21.226
      峰220.30.437
      峰330.10.296

      图  4  胶原蛋白的X射线衍射图谱

    • 蛋白通常含有芳香族氨基酸酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸,这些氨基酸含有苯环共轭双键系统,在特定波长(280 nm和251 nm)处有最大吸收峰。但在胶原蛋白中这些氨基酸含量少,其紫外吸收峰主要集中在220~230 nm,主要是由羰基C=O的n→π跃迁所致。水母胶原蛋白的紫外光谱如图5所示,其最强吸收峰在220 nm处,与牛胶原蛋白吸收峰出现的位置类似,接近Ab Aziz等[11]报道的水母Rhopilema hispidum胶原蛋白紫外吸收峰(218 nm),提示本实验中提取的水母胶原蛋白纯度较高。

      图  5  胶原蛋白紫外光谱

    • 图6可见,水母胶原蛋白酰胺A吸收峰为3288 cm−1,和Rastian等[12]检测的酰胺A(3292 cm−1)吸收峰接近,表明氢键存在于胶原蛋白结构中。胶原蛋白分子中CH2基团的不对称伸缩振动产生了酰胺B特征吸收峰[13-14],水母胶原蛋白的酰胺B在2933 cm−1处,和牛胶原蛋白的酰胺B(2936 cm−1)吸收峰类似。作为蛋白质二级结构变化的特征区域——酰胺Ⅰ带(1625~1690 cm−1),是由蛋白质肽链骨架的C=O伸缩振动产生[15],水母胶原蛋白的酰胺I带出现在1641 cm−1。水母胶原蛋白酰胺II带吸收峰出现在1543 cm−1,在胶原蛋白酰胺II带(1500~1600 cm−1)的范围内,可能是C—N键的伸缩振动和N—H弯曲振动产生。水母胶原蛋白酰胺Ш位于1236 cm−1处,主要是脯氨酸侧链和甘氨酸骨架的—CH2摇摆振动产生,提示所提取的水母胶原蛋白三螺旋结构完整性较好。

      图  6  胶原蛋白的红外光谱

    • 电泳图谱表明提取的水母胶原蛋白达到电泳纯(95%)。文献报道[16-18]天狼星红染料与胶原蛋白中的特征性结构Gly-X-Y结合,可以使用天狼星红染料对胶原蛋白进行快速检测。本实验测得每100 mg冻干的水母胶原蛋白样品中含有胶原蛋白96.85 mg,其纯度为96.85%。

    • 表4所示,水母胶原蛋白的氨基酸组成中,甘氨酸占34.8%,与云南深水鲷鱼皮胶原蛋白甘氨酸含量(35%)接近,比热带淡水鲤鱼鳞中胶原蛋白甘氨酸含量(30.6%)高[19]。水母的胶原蛋白中羟脯氨酸占6.3%,脯氨酸占8.2%,亚氨酸比例为14.5%。其脯氨酸羟基化度(羟脯氨酸含量/亚氨酸含量)为43.68%,比牛胶原蛋白标准品的羟基化度(39.92%)和Zhang等[7]提取的水母胶原蛋白的羟基化度(32.2%)都高。据文献报道[20],羟基化度越高,胶原蛋白的三螺旋结构越稳定。检测结果中还发现蛋氨酸、酪氨酸和组氨酸的含量比较低,缺乏色氨酸,这些都符合I型胶原蛋白的特点[21]

      表 4  二种胶原蛋白中不同氨基酸组分的百分比

      氨基酸名称氨基酸占比(%)
      水母胶原蛋白牛胶原蛋白
      天冬氨酸Asp7.834.57
      苏氨酸Thr3.551.73
      丝氨酸Ser4.893.19
      谷氨酸Glu9.987.27
      甘氨酸Gly34.8234.37
      丙氨酸Ala8.3612.46
      缬氨酸Val2.742.27
      蛋氨酸Met0.210.01
      异亮氨酸Ile1.881.22
      亮氨酸Leu3.092.64
      酪氨酸Tyr0.110.27
      苯丙氨酸Phe0.91.38
      赖氨酸Lys2.962.15
      组氨酸His0.290.48
      精氨酸Arg3.875.3
      脯氨酸Pro8.1612.43
      羟脯氨酸Hyp6.338.26
      合计100100
      注:氨基酸分析采用氨基酸残基数占100个氨基酸残基的比例
    • 图7A可见,当NaCl浓度在0.5~0.8 mol/L时,水母胶原蛋白相对溶解度比较稳定,保持着最大值。其原因可能是低浓度的盐离子可以与胶原蛋白分子结合,使得胶原蛋白分子带有更多的电荷,相互排斥,溶解度较大。当NaCl浓度达到0.9 mol/L时,水母胶原蛋白的溶解度急剧下降,相对溶解度不到23%,当NaCl浓度超过1.0 mol/L后,其相对溶解度在15%左右。可能因为NaCl的浓度较高时,极性较强的盐离子夺走了胶原蛋白结合的水分子,破坏了其周围的水化膜,盐析作用显现出来,溶解度下降。

      图  7  水母胶原蛋白在不同pH值及NaCl浓度条件下溶解度特性

      图7B可见,当溶液的pH在3~5时,水母胶原蛋白的相对溶解度比较大,维持在80%左右。其中pH为4时,溶解度最大,与海参胶原蛋白的溶解性类似[3]。当pH在6~8时,胶原蛋白的相对溶解度维持在较低值,尤以pH 7时溶解度最小,此时就是胶原蛋白的等电点。当pH超过8后,胶原蛋白溶液的溶解度又有所上升。

    • 本实验通过单因素分析和正交实验优化了水母胶原蛋白的提取条件,确定最适条件为:乙酸0.4 mol/L、料液比1∶2 g/mL、胃蛋白酶0.3%、反应72 h。水母胶原蛋白的纯化方法优化为0.9 mol/L-0.9 mol/L-0.9 mol/L NaCl盐析和分子量10万超滤的组合方法。相比阳离子交换层析法和Sephacryl S-100凝胶过滤纯化方法,超滤不仅可以去除盐分和杂蛋白,还能快速富集胶原蛋白,缩短提取时间。

      纯化的水母胶原蛋白通过天狼星红法检测其纯度为97%,高于从其他多种海洋生物提取的I型胶原蛋白纯度[22-23]。本实验中越前水母胶原蛋白干重得率为33%左右,相比于水母Chrysaora quinquecirrha胶原蛋白提取得率(1.2%干重)显著提高[24]。凝胶电泳显示提取的水母胶原蛋白构型可能是(α1)3,α1链分子量约为13万和10万以下基本没有杂条带,比Jankangram等[25]提取的水母胶原蛋白纯度更高。在氨基酸组成分析中,越前水母胶原蛋白甘氨酸占34.82%,羟脯氨酸占6.33%,脯氨酸占8.16%,没有检测到色氨酸。以上结果均表明水母胶原蛋白符合I型胶原蛋白的特点。光谱分析发现,分离纯化过程中水母胶原蛋白三螺旋结构保存较好。溶解度试验表明其在pH=4时溶解性最佳,当NaCl浓度升高至0.9 mol/L时溶解度快速下降。

      总之,本研究通过优化提取纯化过程,缩短了水母胶原蛋白制备时间,提高了所得胶原蛋白的纯度,且水母胶原蛋白三螺旋结构保持完整,与牛I型胶原蛋白特征相似度很高,提示水母胶原蛋白可望成为哺乳动物胶原蛋白的替代品。鉴于水母胶原蛋白具有资源丰富、提取方便、生物相容性好等优点,可望成为生物医药、食品、化妆品等多领域的理想生物材料,具有良好的应用前景。

参考文献 (25)

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