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双波长高效液相色谱法同时测定枇芩口服液中7种成分的含量

王庆芬 刘晓玲 杨育儒 李杰

王庆芬, 刘晓玲, 杨育儒, 李杰. 双波长高效液相色谱法同时测定枇芩口服液中7种成分的含量[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(2): 161-164. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202008007
引用本文: 王庆芬, 刘晓玲, 杨育儒, 李杰. 双波长高效液相色谱法同时测定枇芩口服液中7种成分的含量[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(2): 161-164. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202008007
WANG Qingfen, LIU Xiaoling, YANG Yuru, LI Jie. Simultaneous determination of seven components in Piqin oral liquid by dual-wavelength HPLC[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(2): 161-164. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202008007
Citation: WANG Qingfen, LIU Xiaoling, YANG Yuru, LI Jie. Simultaneous determination of seven components in Piqin oral liquid by dual-wavelength HPLC[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(2): 161-164. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202008007

双波长高效液相色谱法同时测定枇芩口服液中7种成分的含量

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202008007
详细信息
    作者简介:

    王庆芬,硕士研究生,副主任药师,研究方向:医院制剂与质量控制,Email:58221899@qq.com

  • 中图分类号: R917

Simultaneous determination of seven components in Piqin oral liquid by dual-wavelength HPLC

图(1) / 表(3)
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-08-03
  • 修回日期:  2022-01-06
  • 网络出版日期:  2022-03-29
  • 刊出日期:  2022-03-25

双波长高效液相色谱法同时测定枇芩口服液中7种成分的含量

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202008007
    作者简介:

    王庆芬,硕士研究生,副主任药师,研究方向:医院制剂与质量控制,Email:58221899@qq.com

  • 中图分类号: R917

摘要:   目的  建立高效液相色谱法同时测定枇芩口服液中绿原酸、咖啡酸、芍药苷、甘草酸铵、黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素7种成分含量。  方法  采用双波长HPLC,色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为0.02%磷酸水溶液(A)–乙腈(B),梯度洗脱。流速:1.0 ml/min;柱温:35 ℃;进样量:20 μl。检测波长:0~18.0 min,325 nm(检测绿原酸、咖啡酸);18.0~65.0 min,280 nm(检测芍药苷,黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵、汉黄芩素)。  结果  枇芩口服液中的绿原酸、咖啡酸、芍药苷、甘草酸铵、黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素完全分离,7种成分峰面积与浓度的线性关系良好,加样回收率为96.41%~99.70%。  结论  该法操作简单、准确、重复性好,可用于枇芩口服液的质量控制。

English Abstract

王庆芬, 刘晓玲, 杨育儒, 李杰. 双波长高效液相色谱法同时测定枇芩口服液中7种成分的含量[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(2): 161-164. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202008007
引用本文: 王庆芬, 刘晓玲, 杨育儒, 李杰. 双波长高效液相色谱法同时测定枇芩口服液中7种成分的含量[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(2): 161-164. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202008007
WANG Qingfen, LIU Xiaoling, YANG Yuru, LI Jie. Simultaneous determination of seven components in Piqin oral liquid by dual-wavelength HPLC[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(2): 161-164. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202008007
Citation: WANG Qingfen, LIU Xiaoling, YANG Yuru, LI Jie. Simultaneous determination of seven components in Piqin oral liquid by dual-wavelength HPLC[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(2): 161-164. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202008007
  • 枇芩口服液是我院皮肤科的临床经验方,主要由枇杷叶、黄芩、赤芍、甘草等十三味中药制成,具有清热、祛湿、凉血等功效,临床主要用于治疗寻常型痤疮[1]。目前质量控制指标为制剂中的总黄酮以及君药黄芩中的成分[2],不能全面反映制剂的整体质量。组方中黄芩、枇杷叶为君药,具有清热解毒,凉血消肿作用。黄芩活性成分主要为黄酮类化合物,其中黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素抗炎及抑菌效果好。枇杷叶等药材中含有绿原酸和咖啡酸成分,具有抗菌、消炎等作用。组方中的芍药苷及甘草中的甘草酸胺同样具有抗炎、抑菌及免疫调节等功效,诸药合用,在治疗寻常痤疮中发挥协同作用[3]。本研究拟采用双波长高效液相色谱法测定绿原酸、咖啡酸、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵和汉黄芩素含量[4-5],以进一步完善其质量标准。

    • Agilent 1200 Series高效液相色谱系统(含DAD检测器,美国Agilent公司);AUX220电子分析天平(日本岛津公司)。

    • 枇芩口服液(自制,批号:20200220、20200224、20200315);黄芩苷对照品(批号:110715-201821,含量95.4%)、黄芩素对照品(批号:111595-200905,含量98.5%)、绿原酸对照品(批号:110753-201415,含量96.2%)、芍药苷对照品(批号:110736-201337,含量94.9%)、甘草酸铵对照品(批号:110731-201418,含量93.1%),咖啡酸对照品(批号:110885-200102)、汉黄芩素对照品(批号:111514-200403,含量98.0%)均购自中国食品药品检定研究院;乙腈(色谱纯,TEDIA公司,批号:18085030)。

    • Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)为色谱柱;流动相:0.02%磷酸水溶液(A)–乙腈(B)梯度洗脱,洗脱程序:0~10 min,10%B;10~20 min,10%~20%B;20~30 min,20%~25%B;30~40 min,25%~30% B;40~50 min,30%~40% B;50~60 min,40%~70% B; 60~65 min,70%~30% B;65~70 min,30%~10%B;流速:1.0 ml/min;柱温:35 ℃;进样量:20 μl。

      检测波长:0~18.0 min,325 nm(检测绿原酸、咖啡酸);18.0~65.0 min,280 nm(检测芍药苷,黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵、汉黄芩素)。

    • 分别称取各对照品适量,精密称定,加甲醇制成含绿原酸355.9 μg/ml、咖啡酸550.0 μg/ml、芍药苷1480 μg/ml、黄芩苷772.7 μg/ml、黄芩素660.0 μg/ml、甘草酸铵642.4 μg/ml和汉黄芩素499.8 μg/ml的单一对照品储备液。精密吸取上述对照品储备液适量,置于同一10 ml的量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,制得质量浓度依次为35.59、5.500、296.1、77.27、66.00、128.5和1.999 μg/ml的混合对照品溶液。

    • 精密量取相应批号的枇芩口服液2ml,置10 ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液即得。

    • 根据处方中各药的比例,依次制备不含绿原酸(缺茵陈、墨旱莲和枇杷叶)、咖啡酸(缺夏枯草、墨旱莲、枇杷叶和丹参)、赤芍、黄芩和甘草的阴性样品,按“2.2.2”项下供试品溶液制备阴性溶液。

    • 精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性供试品溶液,按照“2.1”项下色谱条件测定,结果见图1。在供试品溶液色谱中,与对照品溶液色谱中绿原酸、咖啡酸、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵和汉黄芩素位置上均有相应的色谱峰出现,且色谱峰之间的分离度均˃1.5,理论板数˃3000。

      图  1  枇芩口服液HPLC色谱图

    • 分别精密吸取对照品储备液0.50、1.00、1.50、2.50、3.50、5.00ml置于5ml棕色量瓶中,加入甲醇稀释至刻度,摇匀。即得系列浓度的混合对照品溶液,按照上述的色谱分析条件进样分析,以浓度(X,μg/ml)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程及线性范围,结果见表1

      表 1  枇芩口服液中有效成分的回归方程、相关系数和线性范围

      有效成分回归方程r线性范围(μg/ml)
      绿原酸Y=18.102X−0.00030.99913.559~35.59
      咖啡酸Y=51.805X+0.08740.99930.5500~5.500
      芍药苷Y=2.2865X+0.58590.999929.61~296.1
      黄芩苷Y=215.23X+43.3490.99997.727~77.27
      黄芩素Y=14.843X−69.4020.99986.600~66.00
      甘草酸铵Y=4.7447X−48.7010.999512.85~128.5
      汉黄芩素Y=413.09X−64.9500.99980.1999~1.999
    • 精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液,按“2.1”项下色谱条件重复进样6次,记录峰面积。结果显示绿原酸、咖啡酸、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵和汉黄芩素峰面积的RSD分别为1.57%、1.98%、1.74%、1.07%、2.01%、1.41%和1.69%,表明仪器精密度良好。

    • 取同一批样品(批号:20200224)6份,按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进样测定峰面积,绿原酸、咖啡酸、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵和汉黄芩素峰面积的RSD分别为1.91%、1.90%、0.68%、1.41%、1.78%、1.40%和1.97%,表明方法重复性良好。

    • 取同一份供试品溶液,分别于0、2、4、6、8、10 h,按“2.1”项下色谱条件进样测定峰面积,绿原酸、咖啡酸、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵和汉黄芩素峰面积的RSD分别为1.05%、1.90%、1.32%、1.06%、1.78%、2.02%和1.87%,结果表明供试品溶液在10 h内稳定。

    • 精密量取已知含量(批号:20200224)的枇芩口服液1ml,共9份,分别按相当于绿原酸、咖啡酸、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵和汉黄芩素含有量的80%、100%、120%加入对照品溶液(不同加入量各3份),按“2.1”项下色谱条件进样,测定含量,并计算加样回收率和RSD,结果见表2

      表 2  枇芩口服液加样回收率测定结果(n=9)

      成 分样品含量
      (µg)
      加入量
      (µg)
      测得量
      (µg)
      回收率
      (%)
      平均回收率
      (%)
      RSD
      (%)
      绿原酸66.4656.94122.498.2498.550.75
      66.4671.18136.298.02
      66.4688.98154.999.39
      咖啡酸11.328.80019.9497.9997.950.67
      11.3211.0022.0297.27
      11.3213.2024.3398.59
      芍药苷638.3493.51117.797.1497.580.67
      638.3592.21220.798.34
      638.3710.61329.397.25
      黄芩苷151.3123.6274.1399.3899.700.61
      151.3154.5304.7399.31
      151.3185. 5337.47100.40
      黄芩素103.784.48187.9399.7198.881.51
      103.7105.6209.0799.78
      103.7132.0231.9397.15
      甘草酸铵115.5102.8217.1798.9098.261.41
      115.5128.5243.099.22
      115.5154.2264.5796.67
      汉黄芩素1.9081.5993.42795.0296.411.41
      1.9081.9993.83796.50
      1.9082.3994.25297.72
    • 取3个批号枇芩口服液(批号:20200220、20200224、20200315),按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进样测定,计算7种成分的含量,结果见表3.

      表 3  枇芩口服液7种成分的含量测定结果(n=3,μg/ml)

      批号绿原酸咖啡酸芍药苷黄芩苷黄芩素甘草酸铵汉黄芩素
      2020022069.5412.11615.3157.399.97112.21.709
      2020022466.4611.32638.3151.3103.7115.51.908
      2020031565.8011.21633.2149.2105.2117.21.911
    • 试验中选择的7种成分来源于黄芩、夏枯草、茵陈、赤芍和甘草,全面覆盖君、臣、佐、使中的多味药材,将其作为质控指标,以提高质量控制的整体性和特征性。因测定成分绿原酸分别存在于组方中茵陈、枇杷叶等药材中,咖啡酸存在于枇杷叶、丹参等药材中,因此按照相应的方法制备阴性供试品溶液。

    • 试验采用高效液相的DAD检测器分别对7种对照品在200~400 nm处扫描,结果绿原酸和咖啡酸在325 nm波长处有最大紫外吸收,芍药苷,黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵、汉黄芩素在280 nm波长处有最大吸收,因此本实验选择325nm和280 nm作为测定波长。

    • 考察了甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.02%磷酸水溶液等流动相系统,结果采用乙腈-0.02%磷酸水溶液梯度洗脱,对照品溶液与供试品溶液各成分分离度较好,梯度洗脱中基线相对平稳,峰形较好。此外,对柱温、流速、进样量等色谱条件进行优化最终确定色谱条件。

参考文献 (5)

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