留言板

尊敬的读者、作者、审稿人, 关于本刊的投稿、审稿、编辑和出版的任何问题, 您可以本页添加留言。我们将尽快给您答复。谢谢您的支持!

姓名
邮箱
手机号码
标题
留言内容
验证码

应中央军委要求,2022年9月起,《药学实践杂志》将更名为《药学实践与服务》,双月刊,正文96页;2023年1月起,拟出版月刊,正文64页,数据库收录情况与原《药学实践杂志》相同。欢迎作者踊跃投稿!

益母草碱对胚胎-胎仔发育毒性和遗传毒性的评价

田逸君 朱玉平 马玺里 严朗 勝呂綸貴子 郑怡文

田逸君, 朱玉平, 马玺里, 严朗, 勝呂綸貴子, 郑怡文. 益母草碱对胚胎-胎仔发育毒性和遗传毒性的评价[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(5): 451-457. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202004105
引用本文: 田逸君, 朱玉平, 马玺里, 严朗, 勝呂綸貴子, 郑怡文. 益母草碱对胚胎-胎仔发育毒性和遗传毒性的评价[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(5): 451-457. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202004105
TIAN Yijun, ZHU Yuping, MA Xili, YAN Lang, SHENGLÜ Lunguizi, ZHENG Yiwen. Evaluation for embryo-fetal developmental toxicity and genetic toxicity of leonurine[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(5): 451-457. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202004105
Citation: TIAN Yijun, ZHU Yuping, MA Xili, YAN Lang, SHENGLÜ Lunguizi, ZHENG Yiwen. Evaluation for embryo-fetal developmental toxicity and genetic toxicity of leonurine[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(5): 451-457. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202004105

益母草碱对胚胎-胎仔发育毒性和遗传毒性的评价

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202004105
详细信息
    作者简介:

    田逸君,硕士,实验师,研究方向:药物安全性评价研究,特殊毒理方向,Email:yijun_tian@163.com

    通讯作者: 郑怡文,博士,讲师,Email:yiwenzheng@sina.com,Tel:(021)81871027
  • 中图分类号: Q95-33

Evaluation for embryo-fetal developmental toxicity and genetic toxicity of leonurine

  • 摘要:   目的  检测益母草碱的发育毒性和遗传毒性。  方法  在SD孕鼠妊娠第6~15天经口灌胃给予500、1 000和2 000 mg/kg体重的益母草碱,同时设溶媒对照组,经口灌胃0.5% CMC-Na溶液。妊娠第20天剖杀孕鼠,分析其生殖毒性。分别采用反映基因突变的鼠伤寒沙门菌回复突变试验(Ames试验)、反映染色体畸变的细胞染色体畸变试验(体外培养CHO)和ICR小鼠骨髓微核试验(体内)检测益母草碱的遗传毒性。  结果  在500、1 000和2 000 mg/kg剂量益母草碱的作用下孕鼠的增重与对照组相比,差异均无统计学意义;各受试剂量组孕鼠各项指标与对照组相比,差异均无统计学意义;各剂量组胎鼠各类指标与溶媒对照组相比,无明显差异。Ames试验结果提示:在0.5、5、50、500、5 000 μg/皿受试剂量下,在有或无代谢活化S9系统时,与溶媒对照组相比,受试物对组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌(TA97、TA98、TA100、TA102及TA1535)所诱发的回复突变菌落数均相近。染色体畸变试验结果显示:250、500和1 000 μg/ml 3个剂量的受试物,对有或无代谢活化系统S9培养的CHO细胞的染色体畸变率无明显影响。微核试验显示100、500和2 000 mg/kg各个剂量组对ICR小鼠的微核诱发率与溶媒对照组比较均无显著差异(P>0.05)。  结论  益母草碱在500、1 000和2 000 mg/kg剂量下未观察到明显的母体毒性、胚胎毒性、胎儿毒性和致畸作用。益母草碱对鼠伤寒沙门菌无致突变性,对哺乳动物培养细胞的染色体无致畸变作用,对ICR小鼠无诱发骨髓嗜多染红细胞微核的效应。上述结果表明在本试验条件下,益母草碱无发育和遗传毒性。
  • 表  1  阳性对照品的名称及剂量

    菌株无代谢活化系统(−S9)有代谢活化系统(+S9)
    阳性对照品名称加入量
    (μl/皿)
    配制浓度
    (µg/ml)
    终浓度
    (µg/皿)
    阳性对照品名称加入量
    (µl/皿)
    配制浓度
    (µg/ml)
    终浓度
    (µg/皿)
    TA97敌克松100500.050.02-氨基芴100100.010.0
    TA98敌克松100500.050.02-氨基芴100100.010.0
    TA100甲基磺酸甲酯100 10.0 1.02-氨基芴100100.010.0
    TA102甲基磺酸甲酯100 10.0 1.01,8-二羟基蒽醌100500.050.0
    TA15354-硝基喹啉-N-氧化物100 5.0 0.5环磷酰胺100500.050.0
    下载: 导出CSV

    表  2  益母草碱对胎鼠生长发育的影响

    观察指标溶媒对照组益母草碱组(mg/kg体重)
    50010002 000
    受检胎鼠数(只)184174160168
    性别比例(雄:雌)93∶9181∶9380∶8088∶80
    活胎体重($ \bar x \pm {\rm{s}}$, g)3.28±0.403.25±0.403.30±0.403.31±0.46
    胎盘重($ \bar x \pm {\rm{s}}$, g)0.56±0.080.55±0.090.56±0.080.55±0.09
    活胎身长($ \bar x \pm {\rm{s}}$, cm)3.60±0.183.57±0.203.57±0.213.61±0.22
    下载: 导出CSV

    表  3  益母草碱对胎鼠骨骼发育的影响

    观察指标溶媒对照组益母草碱组(mg/kg体重)
    50010002 000
    受检胎鼠数(只)  88  85  77  78
    颈椎数7.0±0.07.0±0.07.0±0.07.0±0.0
    胸椎数13.0±0.013.0±0.013.0±0.013.0±0.0
    腰椎数6.0±0.06.0±0.06.0±0.06.0±0.0
    尾椎2.3±0.62.3±0.72.4±0.62.4±0.6
    骶椎数5.5±0.65.5±0.65.6±0.65.5±0.5
    肋骨数13.0±0.013.0±0.013.0±0.013.0±0.0
    胸骨节数4.7±1.14.6±1.15.0±1.24.7±1.0
    掌骨数7.3±1.07.3±1.07.5±0.97.0±1.0
    近端指骨数0.1±0.40.3±1.10.2±0.90.3±1.0
    远端指骨数9.9±0.410.0±0.29.9±0.410.0±0.2
    跖骨数8.0±0.28.0±0.27.9±0.48.0±0.0
    近端跖骨数0.0±0.00.0±0.00.0±0.00.0±0.0
    远端跖骨数10.0±0.310.0±0.29.9±0.410.0±0.0
    下载: 导出CSV

    表  4  益母草碱对胎鼠枕骨发育的影响

    枕骨分级溶媒对照组益母草碱组(mg/kg体重)
    5001 0002 000
    受检胎鼠数(只)88857778
    Ⅰ级枕骨数[n (%)]27(30.7)25(29.4)31(40.3)29(37.2)
    Ⅱ级枕骨数[n (%)]60(68.2)59(69.4)45(58.4)49(62.8)
    Ⅲ级枕骨数[n (%)] 1(1.1) 1(1.2) 1(1.3) 0(0)
    Ⅳ级枕骨数[n (%)]0(0)0(0)0(0)0(0)
    下载: 导出CSV

    表  5  益母草碱对胎鼠胸骨节骨骼发育的影响

    观察指标溶媒对照组益母草碱组(mg/kg体重)
    5001 0002 000
    受检胎鼠数(只)88857778
    胸骨节数4.7±1.14.6±1.15.0±1.24.7±1.0
    骨化不全数0.7±0.80.5±0.60.7±0.70.8±0.7
    未骨化数1.4±1.11.4±1.11.0±1.21.3±1.0
    下载: 导出CSV

    表  6  益母草碱对5支菌株的回变菌落数试验结果(个/皿, $ \bar x \pm {\rm{s}}$)(第1次)

    组别(μg/皿)TA97TA98TA100TA102TA1535
    +S9−S9+S9−S9+S9−S9+S9−S9+S9−S9
    5 00084±570±350±353±786±874±3203±42193±6211±412±5
    50085±1079±832±944±591±1877±13213±80174±119±38±2
    5076±871±637±540±1072±382±15196±24184±139±19±3
    592±1281±133±434±787±1869±13218±50176±89±29±2
    0.586±2571±837±638±982±880±9176±48159±1610±48±2
    空白对照组77±575±635±1242±1190±1477±13207±50194±2512±710±3
    溶媒对照组75±1377±640±1452±490±988±11178±62172±4013±313±1
    阳性对照组745±491 067±176467±115711±87578±61486±34636±41634±32467±82433±15
    下载: 导出CSV

    表  7  益母草碱对5支菌株的回变菌落数(个/皿,$ \bar x \pm {\rm{s}}$)(第2次)

    组别(μg/皿)TA97TA98TA100TA102TA1535
    +S9−S9+S9−S9+S9−S9+S9−S9+S9−S9
    5 00083±780±932±433±894±1693±7211±13196±189±29±6
    50079±1179±1026±430±678±579±7208±6195±79±110±3
    5074±1374±1132±431±395±2786±8187±9195±428±211±2
    586±679±1631±435±583±1085±14179±4177±629±17±2
    0.584±985±726±627±2110±2091±11190±1186±188±212±5
    空白对照组76±580±1432±630±1188±2102±10212±6176±4610±28±1
    溶媒对照组83±379±1229±337±1184±289±9192±15184±338±210±2
    阳性对照组807±5806±90934±64851±163446±40496±21623±23621±37480±35476±53
    下载: 导出CSV

    表  8  益母草碱对24 h体外培养CHO细胞的染色体畸变试验结果(加或不加S9系统)

    组别(μg/ml)观察细胞数
    (个)
    各类染色体畸变数畸变细胞数
    (个)
    畸变率
    (%)
    断裂断片双着
    丝粒
    三辐体四辐体碎片或微小体环状多倍体
    250+S9200 20000000 21.0
    −S9200 20000000 21.0
    500+S9200 10000000 10.5
    −S9200 80000000 31.5
    1 000+S9200 50100000 31.5
    −S9200 10000000 10.5
    溶媒对照组+S9200 20100000 31.5
    溶媒对照组−S9200 20000000 21.0
    阳性对照组+S91002000200001717*
    阳性对照组−S91001830010001818*
    *P<0.05,与溶媒对照组比较。
    下载: 导出CSV

    表  9  益母草碱对小鼠骨髓嗜多染红细胞的微核效应试验结果

    组别(mg/kg体重)性别动物数(只)观察PCE数(个)PCE/NCE($\bar x $±s)微核率($\bar x $±s,‰)
    500 5 5 126 1.17±0.17 2.53±1.48
    5 5 109 1.14±0.24 0.78±0.81*
    1 000 5 5 076 1.19±0.21 2.16±1.28
    5 5 093 1.42±0.14 0.79±1.30*
    2 000 5 5 117 1.15±0.11 2.17±1.47
    5 5 088 1.15±0.20 2.96±2.43
    溶媒对照组 5 5 131 1.07±0.03 4.09±1.88
    5 5 109 1.15±0.11 2.94±0.98
    阳性对照组 5 5 019 1.25±0.09 15.93±7.50*
    5 5 039 1.27±0.16 16.28±3.80*
    *P<0.05,与溶媒对照组比较。
    下载: 导出CSV
  • [1] SHANG X F, PAN H, WANG X Z, et al. <italic>Leonurus</italic> <italic>japonicus</italic> Houtt. : ethnopharmacology, phytochemistry and pharmacology of an important traditional Chinese medicine[J]. J Ethnopharmacol,2014,152(1):14-32. doi:  10.1016/j.jep.2013.12.052
    [2] Kuang P G, Zhou X F, Zhang F Y, et al. Motherwort and cerebral ischemia[J]. J Tradit Chin Med,1988,8:37-40.
    [3] LIU X H, XIN H, HOU A J, et al. Protective effects of leonurine in neonatal rat hypoxic cardiomyocytes and rat infarcted heart[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol,2009,36(7):696-703. doi:  10.1111/j.1440-1681.2008.05135.x
    [4] LIU X H, CHEN P F, PAN L L, et al. 4-Guanidino-n-butyl syringate (Leonurine, SCM 198) protects H9c2 rat ventricular cells from hypoxia-induced apoptosis[J]. J Cardiovasc Pharmacol,2009,54(5):437-444. doi:  10.1097/FJC.0b013e3181bae160
    [5] FISKUM G, ROSENTHAL R E, VERECZKI V, et al. Protection against ischemic brain injury by inhibition of mitochondrial oxidative stress[J]. J Bioenerg Biomembr,2004,36(4):347-352. doi:  10.1023/B:JOBB.0000041766.71376.81
    [6] LIU X H, PAN L L, CHEN P F, et al. Leonurine improves ischemia-induced myocardial injury through antioxidative activity[J]. Phytomedicine,2010,17(10):753-759. doi:  10.1016/j.phymed.2010.01.018
    [7] LIU X H, PAN L L, DENG H Y, et al. Leonurine (SCM-198) attenuates myocardial fibrotic response via inhibition of NADPH oxidase 4[J]. Free Radic Biol Med,2013,54:93-104. doi:  10.1016/j.freeradbiomed.2012.10.555
    [8] 田逸君, 郑怡文, 朱玉平, 等. 雷公藤内酯醇的遗传毒性评价[J]. 药学实践杂志, 2016, 34(3):215-218. doi:  10.3969/j.issn.1006-0111.2016.03.006
    [9] 田逸君, 朱玉平, 朱江波, 等. 草苔虫内酯的遗传毒性评价[J]. 癌变畸变突变. 2012, 24(4): 309-312.
    [10] 国家食品药品监督管理总局. 药物生殖毒性研究技术指导原则[EB/OL]. 2007. https://wenku.baidu.com/view/a9f9c49af78a6529647d5391.html.
    [11] OECD. Test Guidance 414. Prenatal Developmental Toxicity Study. In: OECD Guidance for Testing of Chemicals[S]. Paris: Organization for Economic Cooperation & Development, 2001.
    [12] 国家食品药品监督管理总局. 药物遗传毒性研究技术指导原则[EB/OL]. 2007. https://wenku.baidu.com/view/2e1f1b1985868762caaedd3383c4bb4cf7ecb7a6.html.
    [13] 周海钧主译. ICH 药品注册的国际技术要求(安全性部分)[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2001: 37-61.
    [14] OECD. Test Guidance 471. Bacterial Reverse Mutation Test. In: OECD Guidance For Testing of Chemicals.[S] Paris: Organization for Economic Cooperation & Development, 1997.
    [15] OECD. Test Guidance 474. Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test. In: OECD Guidance for Testing of Chemicals[S]. Paris: Organization for Economic Cooperation & Development, 1997.
    [16] OECD. Test Guidance 473. In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test In: OECD Guidance for Testing of Chemicals[S]. Paris: Organization for Economic Cooperation & Development, 1997.
    [17] 田逸君. 雷公藤内酯醇的遗传毒性研究[D]. 第二军医大学, 2016.
    [18] 田逸君, 张天宝, 朱玉平, 等. 聚乙二醇修饰降纤酶的遗传毒性评价[J]. 中国新药与临床杂志, 2012, 31(5):281-284.
    [19] 张培培, 苏敏, 崔佳丽, 等. HPLC-MS/MS法测定Beagle犬血浆中灯盏乙素酶解产物灯盏乙素苷元[C]. 2016年第六届全国药物毒理学年会论文集, 2016.
    [20] 严婷. 纤溶活性化合物FGFC1的药效学和毒理学的研究[D]. 上海: 上海海洋大学, 2014.
    [21] HONG Z Y, YU S S, WANG Z J, et al. SCM-198 ameliorates cognitive deficits, promotes neuronal survival and enhances CREB/BDNF/TrkB signaling without affecting aβ burden in AβPP/PS1 mice[J]. Int J Mol Sci,2015,16(8):18544-18563. doi:  10.3390/ijms160818544
    [22] SONG X J, WANG T C, ZHANG Z C, et al. Leonurine exerts anti-inflammatory effect by regulating inflammatory signaling pathways and cytokines in LPS-induced mouse mastitis[J]. Inflammation,2015,38(1):79-88. doi:  10.1007/s10753-014-0009-9
    [23] HUANG L Q, YANG X, PENG A L, et al. Inhibitory effect of leonurine on the formation of advanced glycation end products[J]. Food Funct,2015,6(2):584-589. doi:  10.1039/C4FO00960F
    [24] 梁博志, 罗建华, 杨冬花, 等. 益母草碱作用及机制研究进展[J]. 贵阳中医学院学报, 2017, 39(4):93-96.
  • [1] 田逸君, 侍雯靖, 董雅春, 张天宝, 朱玉平.  复方山莨菪碱注射液的遗传毒性评价 . 药学实践与服务, 2023, 41(1): 50-55. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202206035
    [2] 张倩, 郭羽晨, 邓珊珊, 章越凡, 李铁军.  基于网络药理学的益母草治疗神经损伤的潜在分子机制研究 . 药学实践与服务, 2022, 40(2): 113-119. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202105106
    [3] 华荣, 陈瑶.  益母草碱抑制NLRP3炎症小体过度激活调控巨噬细胞M1/M2表型分化 . 药学实践与服务, 2021, 39(2): 143-147. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202101003
    [4] 侍雯婧, 田逸君, 黄才国, 朱玉平, 严朗, 郑怡文.  Wentilactone A的遗传毒性评价 . 药学实践与服务, 2020, 38(6): 533-538. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202004089
    [5] 田逸君, 郑怡文, 朱玉平, 张晓芳, 宗英, 陆国才.  雷公藤内酯醇的遗传毒性评价 . 药学实践与服务, 2016, 34(3): 215-218. doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.2016.03.006
    [6] 赵白云, 李悦悦, 朱臻宇, 赵亮, 戈萌, 张国庆, 柴逸峰.  小柴胡汤毒性成分分析 . 药学实践与服务, 2013, 31(6): 454-458. doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.2013.06.016
    [7] 施志云.  口服布洛芬过量中毒性反应1例 . 药学实践与服务, 1999, (3): 181-181.
    [8] 孙成春, 贾暖, 王景祥.  马钱子的量效关系及毒性作用 . 药学实践与服务, 1998, (2): 84-86,107.
    [9] 边振考, 吕晓顺.  益母草的新用途 . 药学实践与服务, 1998, (5): 320-320.
    [10] 赵爱国, 于峰, 牛桂田, 黄涛.  伤速康换药液的毒性作用研究 . 药学实践与服务, 1997, (4): 195-197.
    [11] 唐国荣, 徐金星.  对乙酰氨基酚的毒性反应及处理 . 药学实践与服务, 1994, (2): 40-43.
    [12] 贾丹兵, 孙佩江, 孙丽滨.  车前草药理及毒性实验的研究 . 药学实践与服务, 1989, (3): 29-31.
    [13] 雷招宝.  异搏定的肝毒性反应 . 药学实践与服务, 1989, (2): 29-30.
    [14] 谭真, 何芬芬.  丁香油毒性 . 药学实践与服务, 1987, (3): 5-5.
    [15] 韩保民, 张紫洞.  阿司匹林对小儿的毒性 . 药学实践与服务, 1986, (1): 28-28.
    [16] 吴蒙慧, 郑长安, 陈树钊, 王福美, 王升毓, 刘彤.  鲎试剂抑制内毒素致死作用及其毒性实验 . 药学实践与服务, 1985, (4): 71-73.
    [17] 衣淑珍, 张紫洞.  毒性反应自学问题解答 . 药学实践与服务, 1985, (1): 67-68.
    [18] 陆晓和.  氨茶碱对老年人的毒性 . 药学实践与服务, 1984, (2): 63-63.
    [19] 李锡岩, 李美兰.  丙硫氧嘧啶的肝毒性 . 药学实践与服务, 1984, (4): 43-43.
    [20] EricJ·Lien.  药物副作用——耳毒性 . 药学实践与服务, 1984, (4): 49-52.
  • 加载中
计量
  • 文章访问数:  2566
  • HTML全文浏览量:  1268
  • PDF下载量:  14
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2020-04-21
  • 修回日期:  2020-06-28
  • 网络出版日期:  2020-09-22
  • 刊出日期:  2020-09-25

益母草碱对胚胎-胎仔发育毒性和遗传毒性的评价

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202004105
    作者简介:

    田逸君,硕士,实验师,研究方向:药物安全性评价研究,特殊毒理方向,Email:yijun_tian@163.com

    通讯作者: 郑怡文,博士,讲师,Email:yiwenzheng@sina.com,Tel:(021)81871027
  • 中图分类号: Q95-33

摘要:   目的  检测益母草碱的发育毒性和遗传毒性。  方法  在SD孕鼠妊娠第6~15天经口灌胃给予500、1 000和2 000 mg/kg体重的益母草碱,同时设溶媒对照组,经口灌胃0.5% CMC-Na溶液。妊娠第20天剖杀孕鼠,分析其生殖毒性。分别采用反映基因突变的鼠伤寒沙门菌回复突变试验(Ames试验)、反映染色体畸变的细胞染色体畸变试验(体外培养CHO)和ICR小鼠骨髓微核试验(体内)检测益母草碱的遗传毒性。  结果  在500、1 000和2 000 mg/kg剂量益母草碱的作用下孕鼠的增重与对照组相比,差异均无统计学意义;各受试剂量组孕鼠各项指标与对照组相比,差异均无统计学意义;各剂量组胎鼠各类指标与溶媒对照组相比,无明显差异。Ames试验结果提示:在0.5、5、50、500、5 000 μg/皿受试剂量下,在有或无代谢活化S9系统时,与溶媒对照组相比,受试物对组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌(TA97、TA98、TA100、TA102及TA1535)所诱发的回复突变菌落数均相近。染色体畸变试验结果显示:250、500和1 000 μg/ml 3个剂量的受试物,对有或无代谢活化系统S9培养的CHO细胞的染色体畸变率无明显影响。微核试验显示100、500和2 000 mg/kg各个剂量组对ICR小鼠的微核诱发率与溶媒对照组比较均无显著差异(P>0.05)。  结论  益母草碱在500、1 000和2 000 mg/kg剂量下未观察到明显的母体毒性、胚胎毒性、胎儿毒性和致畸作用。益母草碱对鼠伤寒沙门菌无致突变性,对哺乳动物培养细胞的染色体无致畸变作用,对ICR小鼠无诱发骨髓嗜多染红细胞微核的效应。上述结果表明在本试验条件下,益母草碱无发育和遗传毒性。

English Abstract

田逸君, 朱玉平, 马玺里, 严朗, 勝呂綸貴子, 郑怡文. 益母草碱对胚胎-胎仔发育毒性和遗传毒性的评价[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(5): 451-457. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202004105
引用本文: 田逸君, 朱玉平, 马玺里, 严朗, 勝呂綸貴子, 郑怡文. 益母草碱对胚胎-胎仔发育毒性和遗传毒性的评价[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(5): 451-457. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202004105
TIAN Yijun, ZHU Yuping, MA Xili, YAN Lang, SHENGLÜ Lunguizi, ZHENG Yiwen. Evaluation for embryo-fetal developmental toxicity and genetic toxicity of leonurine[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(5): 451-457. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202004105
Citation: TIAN Yijun, ZHU Yuping, MA Xili, YAN Lang, SHENGLÜ Lunguizi, ZHENG Yiwen. Evaluation for embryo-fetal developmental toxicity and genetic toxicity of leonurine[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(5): 451-457. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202004105
  • 益母草(Leonurus japonicus Houtt.)作为传统中药,以往主要用于治疗妇产科疾病。近年来的研究发现,益母草中的主要化学成分为生物碱、类黄酮和二萜等[1],其中,益母草碱(4-胍基-正丁基-丁香酸酯,又名SCM-198)是一种具有抗血小板聚集[2]、改善微循环、保护心肌[3-4]等多种生物活性的重要生物碱,有广泛的临床应用前景[5-7]。本研究采用SD大鼠胚胎-胎仔发育毒性试验方法对益母草碱的致畸性进行评价;同时采用Ames试验、体外CHO细胞染色体畸变试验和小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验这3个标准试验组合的方法,分别从体外到体内,从微生物、离体真核细胞到整体动物水平系统检测其致突变性[8-9],旨在为临床安全用药提供参考。

    • 益母草碱(含量99.09%,复旦大学药学院,批号:20110329)。使用前以0.5% CMC-Na溶液配制成混悬液,供试;羧甲基纤维素钠(CMC-Na,批号:F20100420,国药集团化学试剂有限公司);DMSO(批号:T20101110,国药集团化学试剂有限公司);丝裂霉素C(批号:101202,浙江海正药业股份有限公司);环磷酰胺( 批号:10110621,江苏恒瑞药业股份有限公司);敌克松(批号:PS-262)、甲基磺酸甲酯(批号:129925)、4-硝基喹啉-N-氧化物(批号:N8141)、2-氨基芴(批号:A5550-0)、1,8-二羟基蒽醌(批号:S52075-139)均购自Sigma公司;大鼠肝微粒体酶S9(批号:2715,美国Moltox公司);组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌共5支,分别为TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535菌株,由国家上海新药安全性评价中心赠予,储存于液氮中。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞由复旦大学公共卫生学院毒理教研室赠予,储存于液氮中。

    • SD大鼠(SPF级),雌性100只,雄性80只。雌鼠5~6周龄,体重110~140 g;雄鼠6~7周龄,体重150~180 g(上海西普尔-必凯实验动物有限公司);实验动物质量合格证号:2008001629237。ICR小鼠(SPF级),共46只,雌雄各半。雌鼠7~8周龄,体重21~23 g;雄鼠7~8周龄,体重23~25 g(上海西普尔-必凯实验动物有限公司);实验动物质量合格证号:2008001610906。实验动物生产许可证号:SCXK(沪)2008-0016,实验动物使用许可证号:SYXK(沪)2007-0003。

    • 按《药物生殖毒性研究技术指导原则》[10-11]的要求,将雌鼠与雄鼠1:1合笼,交配第2天起对雌鼠进行阴道涂片检查,若显微镜下查见精子则视为交配成功,成功当天即为妊娠GD0。然后将这部分雌鼠按体重随机分为4组,每组20只。急性毒性试验结果提示SD大鼠经口灌胃给予益母草碱,最大耐受量(MTD)>5 000 mg/kg,因此,本试验设高、中、低剂量组(2 000、1 000和500 mg/kg体重),另设溶媒对照组,分别对不同组别的雌鼠连续灌胃给药10 d(给药起止时间为GD6~GD15)。于GD0、GD5、GD6~GD15和GD20 时称取孕鼠的体重。在GD20时处死孕鼠,观察外观是否异常,同时记录其活胎数(区分雌雄)、黄体数、着床数、死胎数等。所有的胎鼠,取其中约一半数量固定于Bouin液中作内脏检查,另一半固定于75%乙醇中制作骨骼标本,用于骨骼畸形检查。

    • 按《药物遗传毒性研究技术指导原则》[12-13]的要求,分别应用反映基因突变的Ames试验[14]、反映染色体畸变的染色体畸变试验(体外培养CHO细胞)[15]和小鼠微核试验(体内)[16]方法。

    • 应用TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535这5支菌株,设5个剂量组(5 000、500、50、5、0.5 μg/皿),此外还设空白对照、溶媒对照和阳性对照组,每个剂量组及对照组均设3个平行皿(具体剂量见表1)。采用标准平板掺入法,使细菌在有或无代谢活化系统S9的条件下接触受试物,并用最低极限的琼脂培养基培养48~72 h后,先用显微镜观察平皿上的菌苔生长情况,确定受试物无明显的抑菌或杀菌作用,再人工计数每皿回复突变的菌落数,记录原始数据,并计算每组的均值和标准差,与溶媒对照组进行比较[8, 17-18]。重复试验一次。

      表 1  阳性对照品的名称及剂量

      菌株无代谢活化系统(−S9)有代谢活化系统(+S9)
      阳性对照品名称加入量
      (μl/皿)
      配制浓度
      (µg/ml)
      终浓度
      (µg/皿)
      阳性对照品名称加入量
      (µl/皿)
      配制浓度
      (µg/ml)
      终浓度
      (µg/皿)
      TA97敌克松100500.050.02-氨基芴100100.010.0
      TA98敌克松100500.050.02-氨基芴100100.010.0
      TA100甲基磺酸甲酯100 10.0 1.02-氨基芴100100.010.0
      TA102甲基磺酸甲酯100 10.0 1.01,8-二羟基蒽醌100500.050.0
      TA15354-硝基喹啉-N-氧化物100 5.0 0.5环磷酰胺100500.050.0
    • 在有或无代谢活化系统S9的条件下,在体外培养的CHO细胞中加入对应的不同浓度的受试物或对照品,反应体系总体积为10 ml。高、中、低剂量组受试物终浓度依次为1000、500和250 μg/ml,阳性对照组丝裂霉素C和环磷酰胺的终浓度分别为0.5、60 μg/ml,另设溶媒对照组分别作用于细胞4 h后换液,继续培养至24 h,最后收集细胞。用秋水仙碱处理所有细胞,将细胞终止在有丝分裂中期,经0.75%氯化钾低渗、1∶3醋酸甲醇固定、滴片和Giemsa染色后,在显微镜下计数和观察染色体的数量或结构是否改变[8, 17-18]

      观察对象的选择为染色体分散良好、数目完整的中期分裂相细胞,采用盲法读片,受试物及溶媒对照组每组观察200个细胞,阳性对照组观察100个细胞,计数染色体或染色单体的断裂、缺失及其他类型结构异常的数目[8, 17-18](裂隙和核内复制一般不作为畸变类型),计算畸变率。

    • 受试物采用经口灌胃的方式(与临床给药途径一致)给药,急性毒性试验结果提示ICR小鼠经口灌胃给予益母草碱,MTD>5 000 mg/kg,故高、中、低剂量分别设为2 000、1 000和500 mg/kg体重,同时设溶媒对照及阳性对照组。给药容积为10 ml/kg体重。以40 mg/kg体重的剂量腹腔注射给予环磷酰胺(阳性对照),给药容量为10 ml/kg体重。溶媒对照组以10 ml/kg体重的容积经口灌胃给予0.5% CMC-Na溶液。小鼠在给药24 h后处死,每只动物取其两侧股骨骨髓,制2张涂片,用甲醇固定,然后用pH6.8的Giemsa染液进行染色。

      每只小鼠镜检1 000个骨髓嗜多染红细胞(PCE),计数含微核的PCE数(MNPCE),计算微核发生率,同时记录200个PCE计数过程中观察到的正染红细胞(NCE)的数目,并计算PCE/NCE值,以评价受试物是否有骨髓毒性[8, 17-18]

    • 使用分析软件SPSS11.0,计量指标采用($ \bar x \pm {\rm{s}}$)表示,各组之间的比较采用方差分析,率的比较采用χ2检验。

    • 比较受试物各剂量组与溶剂对照组的回复突变菌落数,若某剂量组回复突变菌落数为溶剂对照组的2倍以上,呈现可重复性,并在一定的剂量范围内存在剂量-反应关系,则判断为阳性。

    • 染色体畸变细胞的发生率须与溶媒对照组进行比较分析后方可判定,>10%者判为阳性。

    • 采用χ2检验比较给药组与对照组之间的差异是否具有统计学意义。

    • 益母草碱各受试剂量作用下在给药期间(GD6~GD15)、停药后(GD15~GD20)以及整个孕期(GD0~GD20)孕鼠的增重与对照组相比,差异均无统计学意义;各受试剂量组子宫连胎重量、子宫重量、黄体数、着床率、每窝平均活胎数、死胎数和吸收胎数、活胎率、死胎发生率、吸收胎发生率与对照组相比,差异均无统计学意义;此外,各组胎鼠均未观察到内脏和外观畸形的发生。以上研究结果提示,益母草碱在各受试剂量下未观察到明显的母体毒性、胚胎毒性和致畸作用。

      表2可见,受试物各剂量组胎鼠的体重、身长、胎盘重量及性别比例与溶媒对照组相比无明显差异,提示益母草碱在各受试剂量下未观察到明显的胎儿毒性。

      表 2  益母草碱对胎鼠生长发育的影响

      观察指标溶媒对照组益母草碱组(mg/kg体重)
      50010002 000
      受检胎鼠数(只)184174160168
      性别比例(雄:雌)93∶9181∶9380∶8088∶80
      活胎体重($ \bar x \pm {\rm{s}}$, g)3.28±0.403.25±0.403.30±0.403.31±0.46
      胎盘重($ \bar x \pm {\rm{s}}$, g)0.56±0.080.55±0.090.56±0.080.55±0.09
      活胎身长($ \bar x \pm {\rm{s}}$, cm)3.60±0.183.57±0.203.57±0.213.61±0.22

      表3~5可见,受试物各剂量组胎鼠观察指标的数目及发育程度与溶媒对照组相比无明显差异,提示益母草碱在各受试剂量下对胎鼠骨骼的发育未见明显影响。

      表 3  益母草碱对胎鼠骨骼发育的影响

      观察指标溶媒对照组益母草碱组(mg/kg体重)
      50010002 000
      受检胎鼠数(只)  88  85  77  78
      颈椎数7.0±0.07.0±0.07.0±0.07.0±0.0
      胸椎数13.0±0.013.0±0.013.0±0.013.0±0.0
      腰椎数6.0±0.06.0±0.06.0±0.06.0±0.0
      尾椎2.3±0.62.3±0.72.4±0.62.4±0.6
      骶椎数5.5±0.65.5±0.65.6±0.65.5±0.5
      肋骨数13.0±0.013.0±0.013.0±0.013.0±0.0
      胸骨节数4.7±1.14.6±1.15.0±1.24.7±1.0
      掌骨数7.3±1.07.3±1.07.5±0.97.0±1.0
      近端指骨数0.1±0.40.3±1.10.2±0.90.3±1.0
      远端指骨数9.9±0.410.0±0.29.9±0.410.0±0.2
      跖骨数8.0±0.28.0±0.27.9±0.48.0±0.0
      近端跖骨数0.0±0.00.0±0.00.0±0.00.0±0.0
      远端跖骨数10.0±0.310.0±0.29.9±0.410.0±0.0

      表 4  益母草碱对胎鼠枕骨发育的影响

      枕骨分级溶媒对照组益母草碱组(mg/kg体重)
      5001 0002 000
      受检胎鼠数(只)88857778
      Ⅰ级枕骨数[n (%)]27(30.7)25(29.4)31(40.3)29(37.2)
      Ⅱ级枕骨数[n (%)]60(68.2)59(69.4)45(58.4)49(62.8)
      Ⅲ级枕骨数[n (%)] 1(1.1) 1(1.2) 1(1.3) 0(0)
      Ⅳ级枕骨数[n (%)]0(0)0(0)0(0)0(0)

      表 5  益母草碱对胎鼠胸骨节骨骼发育的影响

      观察指标溶媒对照组益母草碱组(mg/kg体重)
      5001 0002 000
      受检胎鼠数(只)88857778
      胸骨节数4.7±1.14.6±1.15.0±1.24.7±1.0
      骨化不全数0.7±0.80.5±0.60.7±0.70.8±0.7
      未骨化数1.4±1.11.4±1.11.0±1.21.3±1.0
    • 受试物各剂量组和对照组的平皿通过肉眼观察均未见污染,并且在显微镜下可见背景菌苔生长。试验结果见表6表7,5个菌株的自发回复突变菌落数以及阳性对照品诱发的回复突变菌落数均在历史对照范围内,并且各菌株阳性对照组的回复突变菌落数与空白对照组相比显著增加,提示本试验系统符合试验要求。在最高剂量已达到5 000 μg/皿的受试条件下,未观察到受试物的抑菌现象[8, 17-19]。各剂量组受试物在有或无代谢活化系统S9的条件下,对5支菌株所诱发的回复突变菌落数均与溶媒对照组的突变菌落数相近,并且未观察到明显的剂量-反应关系(表8)。

      表 6  益母草碱对5支菌株的回变菌落数试验结果(个/皿, $ \bar x \pm {\rm{s}}$)(第1次)

      组别(μg/皿)TA97TA98TA100TA102TA1535
      +S9−S9+S9−S9+S9−S9+S9−S9+S9−S9
      5 00084±570±350±353±786±874±3203±42193±6211±412±5
      50085±1079±832±944±591±1877±13213±80174±119±38±2
      5076±871±637±540±1072±382±15196±24184±139±19±3
      592±1281±133±434±787±1869±13218±50176±89±29±2
      0.586±2571±837±638±982±880±9176±48159±1610±48±2
      空白对照组77±575±635±1242±1190±1477±13207±50194±2512±710±3
      溶媒对照组75±1377±640±1452±490±988±11178±62172±4013±313±1
      阳性对照组745±491 067±176467±115711±87578±61486±34636±41634±32467±82433±15

      表 7  益母草碱对5支菌株的回变菌落数(个/皿,$ \bar x \pm {\rm{s}}$)(第2次)

      组别(μg/皿)TA97TA98TA100TA102TA1535
      +S9−S9+S9−S9+S9−S9+S9−S9+S9−S9
      5 00083±780±932±433±894±1693±7211±13196±189±29±6
      50079±1179±1026±430±678±579±7208±6195±79±110±3
      5074±1374±1132±431±395±2786±8187±9195±428±211±2
      586±679±1631±435±583±1085±14179±4177±629±17±2
      0.584±985±726±627±2110±2091±11190±1186±188±212±5
      空白对照组76±580±1432±630±1188±2102±10212±6176±4610±28±1
      溶媒对照组83±379±1229±337±1184±289±9192±15184±338±210±2
      阳性对照组807±5806±90934±64851±163446±40496±21623±23621±37480±35476±53

      表 8  益母草碱对24 h体外培养CHO细胞的染色体畸变试验结果(加或不加S9系统)

      组别(μg/ml)观察细胞数
      (个)
      各类染色体畸变数畸变细胞数
      (个)
      畸变率
      (%)
      断裂断片双着
      丝粒
      三辐体四辐体碎片或微小体环状多倍体
      250+S9200 20000000 21.0
      −S9200 20000000 21.0
      500+S9200 10000000 10.5
      −S9200 80000000 31.5
      1 000+S9200 50100000 31.5
      −S9200 10000000 10.5
      溶媒对照组+S9200 20100000 31.5
      溶媒对照组−S9200 20000000 21.0
      阳性对照组+S91002000200001717*
      阳性对照组−S91001830010001818*
      *P<0.05,与溶媒对照组比较。
    • 阳性对照组能够诱发受试细胞染色体的畸变率明显增高,24 h在有或无代谢活化系统S9的情况下,染色体畸变率分别为17%和18%,均>10%,为阳性结果;溶媒对照品以及250、500和1 000 μg/ml受试物在24 h、有S9组的染色体畸变率分别为1.5%、1.0%、0.5%和1.5%;24 h、无S9组的染色体畸变率分别为1.0%、1.0%、1.5%和0.5%,综上,溶媒对照组及受试物各剂量组细胞染色体畸变率均小于5%,为阴性结果[8, 17-18]

    • 各剂量组小鼠在给药后均未见异常。微核试验阅片结果见表9。益母草碱在各受试剂量下未观察到对小鼠骨髓的抑制作用,溶媒对照组雌性和雄性小鼠骨髓的PCE微核发生率分别为4.09‰和2.94‰,阳性对照组雌性和雄性小鼠骨髓PCE微核发生率分别为15.93‰和16.28‰,与溶媒对照组相比,差异均有统计学意义,受试物在500、1 000、2 000 mg/kg剂量下对雌性ICR小鼠骨髓PCE微核诱发率分别为2.53‰、2.16‰和2.17‰,对雄性ICR小鼠骨髓PCE微核诱发率分别为0.78‰、0.79‰和2.96‰,由上述结果可见,受试物各剂量组均未诱发ICR小鼠骨髓PCE微核率的明显增高[8, 17-18, 20]

      表 9  益母草碱对小鼠骨髓嗜多染红细胞的微核效应试验结果

      组别(mg/kg体重)性别动物数(只)观察PCE数(个)PCE/NCE($\bar x $±s)微核率($\bar x $±s,‰)
      500 5 5 126 1.17±0.17 2.53±1.48
      5 5 109 1.14±0.24 0.78±0.81*
      1 000 5 5 076 1.19±0.21 2.16±1.28
      5 5 093 1.42±0.14 0.79±1.30*
      2 000 5 5 117 1.15±0.11 2.17±1.47
      5 5 088 1.15±0.20 2.96±2.43
      溶媒对照组 5 5 131 1.07±0.03 4.09±1.88
      5 5 109 1.15±0.11 2.94±0.98
      阳性对照组 5 5 019 1.25±0.09 15.93±7.50*
      5 5 039 1.27±0.16 16.28±3.80*
      *P<0.05,与溶媒对照组比较。
    • 益母草作为传统中药,其应用广泛且历史悠久,主要用于治疗月经不调、痛经、恶露等妇科疾病,同时还用于消肿化瘀、排水利尿。而现代医学已证明益母草中的生物碱——益母草碱在其中发挥了主要功效,益母草碱具有溶栓、抗凝、降低血脂和血液黏度、抑制红细胞和血小板聚集[2]等多种功能,对改善微循环、抗自由基活性和减少细胞内钙超载[3-4]也有显著作用。上述功能有助于预防心血管疾病和脑血管疾病,抑制心肌纤维化[7]、改善认知、促进神经元修复[21]、抗炎[22]、防治糖尿病[23]等,因此,益母草碱在心脑血管、代谢病、肾病、生殖[24]等临床研究领域有相当广泛的应用前景[5-7]。进行安全性评价是药物研发和安全使用的重要环节,但目前对益母草碱的基础毒性和特殊毒性的研究尚未见相关文献报道。研究其遗传毒性和生殖毒性对于临床安全用药具有重要的指导意义。

      本研究采用国际通用的研究方法,对益母草碱的生殖毒性和遗传毒性进行了系统的评价。在胚胎-胎仔发育毒性研究中,自大鼠胚胎着床至硬腭闭合这个阶段孕鼠口服益母草碱,通过观察受试物对妊娠动物、胚胎及胎仔发育的影响检测其致畸性。药物遗传毒性的研究根据国家相关标准,必须遵循原核生物与真核生物、体内系统与体外系统相结合的原则进行,本研究采用Ames试验、体外CHO细胞染色体畸变试验和小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验三者标准组合方案,其检测范围涵盖了基因突变、染色体结构和数目畸变等多个遗传学终点。Ames试验用于检测DNA损伤引起的基因突变,组氨酸营养缺陷型(his-)鼠伤寒沙门菌在受到诱变剂作用后会发生大量回复突变,可自行合成组氨酸,形成肉眼可见的菌落。某些化学物质需经代谢活化后才具有致突变作用,因此,在测试系统中又设置了平行组加入哺乳动物微粒体酶,以弥补体外试验缺乏代谢活化系统的不足。染色体畸变试验常用于检测化合物是否引起细胞染色体结构和数目的改变。诱变因素在损伤染色体的同时也可能损伤纺锤体,从而导致染色体的丢失并形成微核,应用微核试验检测染色体或有丝分裂器的损伤,具有直观、简便等优势[9]

      研究结果显示,在本试验剂量条件下,益母草碱未观察到明显的胚胎-胎仔发育毒性以及遗传毒性,该结论可为益母草碱在临床上的安全使用提供参考和指导,有助于降低用药风险。

参考文献 (24)

目录

    /

    返回文章
    返回