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全身过表达人METRNL基因小鼠模型的构建与验证

王雪莲 郑斯莉 李志勇 罗亨宇 缪朝玉

王雪莲, 郑斯莉, 李志勇, 罗亨宇, 缪朝玉. 全身过表达人METRNL基因小鼠模型的构建与验证[J]. 药学实践与服务, 2024, 42(5): 198-202, 222. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202311014
引用本文: 王雪莲, 郑斯莉, 李志勇, 罗亨宇, 缪朝玉. 全身过表达人METRNL基因小鼠模型的构建与验证[J]. 药学实践与服务, 2024, 42(5): 198-202, 222. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202311014
WANG Xuelian, ZHENG Sili, LI Zhiyong, LUO Hengyu, MIAO Chaoyu. Construction and validation of a mouse model with systemic overexpression of human METRNL gene[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(5): 198-202, 222. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202311014
Citation: WANG Xuelian, ZHENG Sili, LI Zhiyong, LUO Hengyu, MIAO Chaoyu. Construction and validation of a mouse model with systemic overexpression of human METRNL gene[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(5): 198-202, 222. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202311014

全身过表达人METRNL基因小鼠模型的构建与验证

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202311014
基金项目: 国家自然科学基金重点项目(82030110,82330117);国家自然科学基金青年科学基金项目(82104165);上海市青年科技英才扬帆计划(21YF1457600)
详细信息
    作者简介:

    王雪莲,硕士研究生,研究方向:心脑血管药理学,Tel:19822717670,Email:649459125@qq.com

    通讯作者: 缪朝玉,教授,博士生导师,研究方向:心脑血管药理学,Email:cymiao@smmu.edu.cn
  • 中图分类号: [文章编号] 2097-2024(2024)00-0000-00 [DOI] 10.12206 /j.issn.2097-2024.202311014

Construction and validation of a mouse model with systemic overexpression of human METRNL gene

图(6) / 表(2)
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出版历程
  • 收稿日期:  2023-11-08
  • 录用日期:  2024-03-12
  • 修回日期:  2024-02-17
  • 网络出版日期:  2024-05-22
  • 刊出日期:  2024-05-25

全身过表达人METRNL基因小鼠模型的构建与验证

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202311014
    基金项目:  国家自然科学基金重点项目(82030110,82330117);国家自然科学基金青年科学基金项目(82104165);上海市青年科技英才扬帆计划(21YF1457600)
    作者简介:

    王雪莲,硕士研究生,研究方向:心脑血管药理学,Tel:19822717670,Email:649459125@qq.com

    通讯作者: 缪朝玉,教授,博士生导师,研究方向:心脑血管药理学,Email:cymiao@smmu.edu.cn
  • 中图分类号: [文章编号] 2097-2024(2024)00-0000-00 [DOI] 10.12206 /j.issn.2097-2024.202311014

摘要:   目的  构建全身过表达人METRNL基因的小鼠模型(R26-L-METRNL+/-小鼠)。  方法  基于Cre-loxP系统利用Dppa3-Cre小鼠和实验室前期构建的人METRNL基因条件性过表达(R26-LSL-METRNL+/-)小鼠进行交配繁殖,得到目标R26-L-METRNL+/-小鼠。将该目标小鼠进行基因型鉴定,收集其血液及心、肝、脾、肺、肾、脑、白色脂肪和肌肉组织,利用实时荧光定量PCR技术、蛋白免疫印迹实验和血清酶联免疫吸附实验,考察人METRNL基因在小鼠的表达情况。  结果  R26-L-METRNL+/- 小鼠的人METRNL在组织mRNA水平、组织蛋白水平和血液蛋白浓度方面都有显著表达,远高于野生对照组小鼠。  结论  R26-L-METRNL+/-小鼠模型构建成功。

English Abstract

王雪莲, 郑斯莉, 李志勇, 罗亨宇, 缪朝玉. 全身过表达人METRNL基因小鼠模型的构建与验证[J]. 药学实践与服务, 2024, 42(5): 198-202, 222. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202311014
引用本文: 王雪莲, 郑斯莉, 李志勇, 罗亨宇, 缪朝玉. 全身过表达人METRNL基因小鼠模型的构建与验证[J]. 药学实践与服务, 2024, 42(5): 198-202, 222. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202311014
WANG Xuelian, ZHENG Sili, LI Zhiyong, LUO Hengyu, MIAO Chaoyu. Construction and validation of a mouse model with systemic overexpression of human METRNL gene[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(5): 198-202, 222. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202311014
Citation: WANG Xuelian, ZHENG Sili, LI Zhiyong, LUO Hengyu, MIAO Chaoyu. Construction and validation of a mouse model with systemic overexpression of human METRNL gene[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(5): 198-202, 222. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202311014
  • METRNL(Meteorin-like)是一个新发现的分泌蛋白,为神经营养调节因子Meteorin的同源蛋白。2014年,本实验室首次报道METRNL是一个新的脂肪因子,由于其在皮下白色脂肪组织中表达很丰富,故也称为Subfatin[1]。10年来,我们对METRNL的功能进行了多方面的探索,并不断扩展METRNL的研究工具与平台。我们的研究已发现,该蛋白参与调节机体多种病理生理过程,比如:脂肪细胞METRNL可促进白色脂肪分化、脂质代谢并抑制脂肪炎症,从而抵抗高脂饮食诱导的胰岛素抵抗[2];肠上皮细胞METRNL参与调节肠道抗菌肽的平衡[3],且肠道METRNL缺乏会加重溃疡性结肠炎[4];此外,METRNL促进小鼠皮肤创伤愈合[5],并能对抗D-半乳糖诱导的衰老小鼠的认知功能障碍[6]。最近,我们新报道了血液METRNL的主要分泌来源是血管内皮细胞,并发现内皮细胞METRNL对维持血管内皮正常功能和对抗动脉粥样硬化具有重要作用[7]。在这些研究中,我们构建METRNL基因的全身性和各种组织特异性的敲除小鼠,以及多种双基因敲除小鼠,并在体外细胞实验中充分利用METRNL重组蛋白探索相关治疗学意义。除了本实验室,全球其他多个实验室也展开了对METRNL的功能探索,并发现METRNL在能量代谢[8-9]、炎症[10-11]、心脏疾病[12-13]等多种病理生理过程中发挥积极作用。

    尽管目前有很多关于METRNL的研究结果提示,该蛋白具有非常好的临床治疗潜力,但有关整体METRNL治疗学探索不多,尤其是长期治疗研究几乎没有。主要原因之一是市场METRNL重组蛋白价格昂贵,而且我们前期研究结果发现:对C57BL/6J 小鼠单次静脉注射1.75 µg METRNL重组蛋白后,血清METRNL在15 min后急剧升高(226 ng/ml),接着在4 h内迅速下降约90%。虽然在注射后24 h仍明显高于基础水平,但此时血中METRNL浓度已下降约97%[2]。因此,以重组蛋白给药方式在动物整体水平研究METRNL的治疗学作用,尤其是长期治疗学作用将产生巨大经济成本。另一方面,对于一些已经体现METRNL治疗潜力的疾病(如动脉粥样硬化),疾病发展缓慢,短期给予METRNL重组蛋白很难起到治疗作用。

    因此,本研究旨在构建一株长期稳定高表达METRNL的小鼠作为METRNL的治疗学研究工具,并对该小鼠高表达METRNL的情况进行验证。

    • 鼠尾DNA提取试剂盒(CW2094S)购自北京康伟试剂生物科技有限公司;5 × PrimeScript RT Master Mix(Takara 公司);小鼠Tubulin抗体( AT819,碧云天公司);通用型RNA提取试剂盒Ⅱ(AG21022,艾瑞克生物科技);Human Meteorin-like/METRNL DuoSet ELISA试剂盒(DY7867-05,R&D system公司);山羊抗兔 IgG(ab175471)、山羊抗小鼠 IgG(ab216772)、抗METRNL抗体(ab235775)购自Abcam公司。

      LightCycler96实时荧光定量PCR仪(Roche公司);TP600PCR仪(Takara公司);5200S化学发光分析系统(Tanon公司)。

    • METRNL基因条件性过表达(R26-LSL-METRNL+/-)小鼠为实验室前期构建所得。SPF级8周龄 C57BL/6J 小鼠和Dppa-Cre小鼠购自上海南方模式生物技术有限公司。

      所有实验小鼠均饲养在独立通气笼盒(IVC)系统中,温度(24±2)℃,相对湿度为40%~60%,饲养期间笼盒内保持清洁,小鼠在笼内自由活动、进食及饮水,动物房内照明系统为自动控制(12 h照明、12 h黑暗)。动物实验标准均依照国家《实验动物护理使用卫生指南》,并经过海军军医大学医学研究伦理委员会批准指导。

    • 将剪刀消毒后剪取小鼠尾尖约3 mm,剪碎,按照DNA提取试剂盒的说明书方法提取DNA之后,对目的基因进行PCR扩增,各引物序列见表1

      表 1  PCR扩增实验中的引物序列

      基因名称上游引物(5’→3’)下游引物(5’→3’)
      R26-WTTCAGATTCTTTTATAGGGGACACATAAAGGCCACTCAATGCTCACTAA
      R26-L-METRNLAAAGTCCCGGAAAGGAGCTGGAGGCTCCATCCAGCAAGTT
      R26-StopGGGCAACGTGCTGGTTATTGACTTGCCCCTTGCTCCATAC
      内参基因TGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGTGATCCACCTGTCTCTGCCTTCC
      Dppa-CreTGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGTGACCTTGCATTCCTTTGGCGAGAG

      将PCR产物进行1.2% 琼脂糖凝胶电泳,上样量为每孔6 μl,电泳条件为100 V,30 min,结束后进行拍照、分析。

    • 将小鼠称重后,腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液(100 mg/kg),待小鼠处于深度麻醉后,打开其胸腔,自上下腔静脉汇合处缓慢抽取血液,并转移至1.5 ml EP管静置于室温。迅速剪取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、白色脂肪和肌肉组织,放入组织冻存管扔进液氮速冻,待取材结束后及时转入−80 ℃超低温冰箱储存。血液于室温静置2 h后离心:4 ℃,3000×g,15 min,分离血清,储存至−80 ℃超低温冰箱。

    • 使用RNA提取试剂盒提取组织RNA,将得到的RNA进行浓度测定与吸光度测定后进行逆转录,得到cDNA用于实时荧光定量PCR实验,各引物序列见表2

      表 2  实时荧光定量PCR实验中的引物序列

      基因名称上游引物(5′→3′)下游引物(5′→3′)
      METRNLACCAGCGACTTCGTAATTCACCAGCTCCACGTCATGGGTG
      小鼠 Gapdh GTATGACTCCACTCACGGCAAAGGTCTCGCTCCTGGAAGATG
    • 取适量组织至2 ml高速离心管,加入蛋白裂解液后,使用高通量匀浆仪匀浆240 s。取出高速离心管,离心:12000 × g,20 min。将上清液转移至另一干净1.5 ml EP管中,进行蛋白浓度测定,剩余样品加入5 × 蛋白上样缓冲液,97 ℃变性10 min得到蛋白样品。

      使用10% SDS-PAGE凝胶进行电泳,电泳条件为:150 V,60 min。使用PVDF膜进行转膜,转膜条件为100 V,60 min。

      转膜结束后,使用快速封闭液封闭15 min,之后使用1×TBST缓冲液洗膜,5 min × 3次。加入一抗(1∶1000稀释)4 ℃孵育过夜。次日去除一抗孵育液,使用1 × TBST缓冲液洗膜,5 min × 3次。加入二抗孵育液(1∶2 000稀释)常温孵育1 h,用1 × TBST缓冲液洗去二抗,5 min × 4次,结束后即可进行扫膜。

    • 使用酶联免疫吸附实验试剂盒(DY7867-05)测定小鼠血清中的METRNL水平,具体操作按照试剂盒说明书进行。

    • 实验数据使用GraphPad Prism 8.0进行统计分析。两组间的比较使用双尾t检验,P<0.05视为差异有统计学意义。

    • 本研究基于前期构建好的人METRNL基因条件性过表达小鼠(简称为R26-LSL-METRNL+/-小鼠)和Cre-LoxP技术,最终获得全身过表达人METRNL基因小鼠(简称为R26-L-METRNL+/-小鼠),具体构建策略如图1所示。

      图  1  全身过表达人METRNL基因小鼠的构建策略

      R26-LSL-METRNL+/-小鼠是前期通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建而成,即在其中一个Rosa26基因位点定点插入了CAG-LoxP-Stop-LoxP-METRNL-3XFlag-Wpre-pA表达框,且该表达框的终止密码子Stop两侧插有同向LoxP位点,可基于Cre-loxP系统在Cre酶的作用下,将LoxP位点之间的序列切除,只留下一个LoxP位点,最终达到人METRNL基因过表达的目的。在该小鼠的名称“R26-LSL-METRNL+/-”中,“+”表示有外源基因表达框的插入,“-”表示无外源基因表达框插入。

      Dppa3-Cre小鼠是由Dppa3基因启动子介导Cre重组酶在全身表达的工具鼠,将R26-LSL-METRNL+/-小鼠和Dppa3-Cre小鼠杂交,可获得R26-L-METRNL+/-小鼠,具体繁殖方法如图2所示。其中,野生对照小鼠简写为R26-WT,表示在Rosa26位点没有外源人METRNL基因表达框的插入。

      图  2  全身过表达人METRNL基因小鼠的培育流程

      在繁殖过程中进行基因型鉴定时,需确认外源人METRNL基因表达框、终止密码子StopDppa-Cre基因的存在情况。采用相应基因上下游引物分别进行鼠尾基因型鉴定,外源性表达框阳性条带为699 bp,对应野生型序列条带为996 bp,终止密码子Stop阳性条带为408 bp,Cre基因阳性条带为100 bp。如图3所示,泳道1为R26-LSL-METRNL+/-小鼠,泳道2为R26-L-METRNL+/-小鼠,泳道3为R26-WT小鼠,泳道4为R26-L-METRNL+/-Cre小鼠,泳道5为R26-WT;Cre小鼠。

      图  3  DNA电泳条带图

    • 为验证R26-L-METRNL+/-小鼠是否存在人METRNL基因过表达,本研究首先利用实时荧光定量PCR技术检测了该小鼠各组织中人METRNL mRNA的表达情况。如图4所示,以 R26-WT 小鼠白色脂肪的人 METRNL mRNA表达量为1,肝、脾、肺、肾、白色脂肪和脑组织的相对表达量分别为94 008.6、618.1、88 537.3、68 897.9、32 386.3和24 816.5。该结果说明,R26-L-METRNL+/-小鼠在组织mRNA水平上实现了人METRNL基因过表达。

      图  4  R26-L-METRNL+/-小鼠各组织的METRNL mRNA相对表达量(n=5~6,$ \bar x \pm s $

    • 接着,本研究提取各组织的蛋白,使用蛋白免疫印迹实验方法验证R26-L-METRNL+/-小鼠各组织中人METRNL蛋白表达情况。在该实验中,所用METRNL抗体可同时抗人和小鼠的METRNL蛋白。如图5所示,METRNL蛋白在R26-L-METRNL+/-小鼠的心、肝、脾、肺和肌肉组织中的含量明显高于R26-WT小鼠,而在肾组织中METRNL抗体的结合效果不佳,且并未发现两组小鼠肾METRNL蛋白存在明显差异。该结果提示,R26-L-METRNL+/-小鼠在组织蛋白水平上实现了人METRNL基因过表达。

      图  5  R26-L-METRNL+/-小鼠各组织的METRNL 蛋白表达情况

    • 由于METRNL为分泌性蛋白,本研究最后使用ELISA方法测定R26-L-METRNL+/-小鼠及其对照小鼠血清中人METRNL蛋白水平。如图6所示,可成功检测到R26-L-METRNL+/-小鼠血液中的人METRNL,浓度在1 100.3~1 579.3 pg/ml,而在R26-WT小鼠血液中检测不到人METRNL。该结果说明,R26-L-METRNL+/-小鼠的血液中存在大量人METRNL蛋白,提示R26-L-METRNL+/-小鼠实现了人METRNL基因过表达。

      图  6  R26-L-METRNL+/-小鼠及其对照小鼠的血清METRNL蛋白水平(n=5,$ \bar x \pm s $

    • 本研究利用Dppa-Cre小鼠和实验室前期构建的R26-LSL-METRNL+/-小鼠进行杂交繁殖,最终获得R26-L-METRNL+/-小鼠。该小鼠与R26-LSL-METRNL+/-小鼠都在Rosa26基因位点含有外源性基因表达框,不同的是在R26-L-METRNL+/-小鼠外源表达框中的终止密码子Stop被Cre酶成功切除,因此R26-L-METRNL+/-小鼠可实现全身细胞过表达人METRNL

        本研究从mRNA水平、组织蛋白水平和血清蛋白水平考察了R26-L-METRNL+/-小鼠过表达METRNL的情况。由于该小鼠插入的外源METRNL基因是人METRNL基因,因此在进行实时荧光定量PCR实验时,使用的是人METRNL引物和小鼠Gapdh引物。类似地,在ELISA实验中,使用的是检测人METRNL的试剂盒。由于没有特异性抗人的METRNL抗体,因此在蛋白免疫印迹实验中使用的是可同时抗人和小鼠的METRNL抗体,而内参使用的是抗鼠的Tubulin抗体。本研究结果显示,R26-L-METRNL+/-小鼠的各组织存在人METRNL mRNA高表达,虽然各组织的表达量有所波动,但都比R26-L-WT小鼠的表达量高几千倍甚至是数十万倍。蛋白免疫印迹实验结果显示,在R26-L-METRNL+/-小鼠的心、肝、脾、肺、肌肉组织存在明显升高的METRNL蛋白水平,但该实验中检测的METRNL蛋白量升高倍数不多,可能与使用的METRNL抗体可以同时抗人和小鼠的METRNL有关。另外,我们也注意到两组小鼠肾组织的METRNL蛋白水平并没有明显差异,并且两组条带都非常微弱,为确证实验结果,我们进行了重复实验,得出相同结果。经过分析可能是因为该METRNL抗体对肾组织蛋白的亲和力不是很高,导致检测出的蛋白绝对量都太低而使两组之间很难出现差异。在血清水平,本研究结果提示R26-L-METRNL+/-小鼠的血液中存在大量人METRNL蛋白,而R26-L-WT小鼠血中检测不到该蛋白,说明R26-L-METRNL+/-小鼠成功过表达人METRNL,并可以成功分泌至血液中。同时,该实验提示,本研究所使用的人METRNL ELISA试剂盒特异性比较好,可以清晰区别人和鼠来源的METRNL蛋白。

      在小鼠培育过程当中,尚未发现R26-L-METRNL+/-小鼠和同窝对照WT小鼠在体重、形态等方面有何差异。根据图2中R26-L-METRNL+/-小鼠的培育方式,采用R26-L-METRNL+/-小鼠与C57BL/6J 小鼠杂交进行扩大繁殖和保种,基于孟德尔遗传定律,后代鼠中R26-L-METRNL+/-小鼠理论得率为50%,但实际中,我们发现该小鼠的得率仅为15%左右,远低于理论值。这一现象非常有趣,因为此前本实验室构建过多种基因工程动物模型,均没有发现类似偏离孟德尔遗传定律的现象,而这一现象是否与METRNL蛋白的全身性过表达有关,值得我们进一步研究。

参考文献 (13)

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