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应中央军委要求,2022年9月起,《药学实践杂志》将更名为《药学实践与服务》,双月刊,正文96页;2023年1月起,拟出版月刊,正文64页,数据库收录情况与原《药学实践杂志》相同。欢迎作者踊跃投稿!

大黄的HPLC指纹图谱及禁用农药的残留研究

毛泽玲 文波

毛泽玲, 文波. 大黄的HPLC指纹图谱及禁用农药的残留研究[J]. 药学实践与服务. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202310057
引用本文: 毛泽玲, 文波. 大黄的HPLC指纹图谱及禁用农药的残留研究[J]. 药学实践与服务. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202310057
MAO Zeling, WEN Bo. HPLC fingerprint of Radix Rhubarb and forbidden pesticide residues[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202310057
Citation: MAO Zeling, WEN Bo. HPLC fingerprint of Radix Rhubarb and forbidden pesticide residues[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202310057

大黄的HPLC指纹图谱及禁用农药的残留研究

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202310057
基金项目: 杭州市卫生科技计划项目(B20210302)
详细信息
    作者简介:

    毛泽玲,主管中药师,研究方向:中药活性成分及质量标准研究,Tel:15757165880,Email:876231359@qq.com

    通讯作者: 文 波,高级工程师,研究方向:中药质量标准研究,Tel:18067998908,Email:wenborin@126.com

HPLC fingerprint of Radix Rhubarb and forbidden pesticide residues

  • 摘要:   目的  建立不同种大黄的HPLC特征指纹图谱和禁用农药残留检测方法,并综合评价其药材质量。  方法  收集3种大黄共20批,采用HPLC法进行分析,流动相为甲醇-0.1 %磷酸溶液;梯度洗脱;柱温35 ℃;检测波长254 nm;流速1.0 ml/min;并对结果进行聚类分析。采用直接提取法,并建立HPLC-串联质谱法,气相色谱-串联质谱法,对不同来源、产地大黄的33种禁用农药进行检测。  结果  掌叶大黄、唐古特大黄、药用大黄3种来源大黄的指纹图谱与其对照指纹图谱的相似度均>0.95,聚类分析将20批大黄样品分为3类。不同产地的大黄样品均未检出33种禁用农药。  结论  3种大黄药材质量差异较大,建立的HPLC指纹图谱和禁用农残的方法稳定、可靠、简便准确,可以为大黄的质量控制评价提供依据。
  • 图  1  20批大黄叠加指纹图谱

    T1-T5.唐古特大黄样品;Y1-Y7.药用大黄样品;Z1-Z8.掌叶大黄样品

    图  2  混合对照品及3种基原大黄对照图谱

    A.混合对照品;B.唐古特大黄;C.药用大黄;D.掌叶大黄;1.芦荟大黄素;2.大黄素;3.大黄酚;4.大黄素甲醚

    图  3  大黄样品聚类分析树状图

    表  1  20批大黄采集信息表

    编号来源产地采集时间
    1唐古特大黄青海海东2021年9月
    2唐古特大黄青海海东2021年9月
    3唐古特大黄青海玉树2021年9月
    4唐古特大黄青海玉树2021年9月
    5唐古特大黄青海玉树2021年9月
    6药用大黄四川绵阳2021年9月
    7药用大黄四川绵阳2021年9月
    8药用大黄四川阿坝州2021年9月
    9药用大黄湖北恩施州2021年9月
    10药用大黄四川阿坝州2021年9月
    11药用大黄湖北恩施州2021年9月
    12药用大黄四川阿坝州2021年9月
    13掌叶大黄甘肃陇南2021年9月
    14掌叶大黄甘肃陇南2021年9月
    15掌叶大黄甘肃陇南2021年9月
    16掌叶大黄甘肃宕县2021年9月
    17掌叶大黄甘肃宕县2021年9月
    18掌叶大黄甘肃礼县2021年9月
    19掌叶大黄甘肃礼县2021年9月
    20掌叶大黄甘肃礼县2021年9月
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    表  2  梯度洗脱条件

    时间(t/min)流动相(A)流动相(B)
    0.01090
    5.02575
    45.06040
    60.07030
    70.08020
    90.08020
    90.11090
    100.11090
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    表  3  掌叶大黄相似度结果

    序号S1S2S3S4S5S6S7S8对照
    S11.0000.9690.9930.9890.9800.9760.9950.9860.991
    S20.9691.0000.9890.9930.9930.9890.9860.9930.993
    S30.9930.9891.0000.9970.9930.9900.9980.9980.999
    S40.9890.9930.9971.0000.9970.9860.9960.9960.998
    S50.9800.9930.9930.9971.0000.9820.9890.9940.995
    S60.9760.9890.9900.9860.9821.0000.9890.9930.992
    S70.9950.9860.9980.9960.9890.9891.0000.9960.998
    S80.9860.9930.9980.9960.9940.9930.9961.0000.999
    对照0.9910.9930.9990.9980.9950.9920.9980.9991.000
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    表  4  唐古特大黄相似度结果

    序号 S1 S2 S3 S4 S5 对照
    S1 1.000 0.992 0.987 0.996 0.990 0.996
    S2 0.992 1.000 0.992 0.994 0.994 0.997
    S3 0.987 0.992 1.000 0.987 0.998 0.996
    S4 0.996 0.994 0.987 1.000 0.994 0.997
    S5 0.990 0.994 0.998 0.994 1.000 0.998
    对照 0.996 0.997 0.996 0.997 0.998 1.000
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    表  5  药用大黄相似度结果

    序号S1S2S3S4S5S6S7对照
    S11.0000.9840.9640.9960.9780.9920.9780.996
    S20.9841.0000.9120.9800.9510.9940.9770.986
    S30.9640.9121.0000.9750.9770.9380.9410.964
    S40.9960.9800.9751.0000.9870.9900.9830.998
    S50.9780.9510.9770.9871.0000.9760.9840.987
    S60.9920.9940.9380.9900.9761.0000.9900.996
    S70.9780.9770.9410.9830.9840.9901.0000.991
    对照0.9960.9860.9640.9980.9870.9960.9911.000
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    表  6  流动相梯度洗脱程序

    时间(t/min)流动相A(%)流动相B(%)
    0~17030
    1~1270→030→100
    12~140100
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    表  7  线性参数表

    农药测定方法线性范围(µg/L)线性回归方程相关系数
    甲胺磷LC-MS/MS5.10~102Y=5 757.95X-9 518.720.999 7
    涕灭威亚砜LC-MS/MS9.95~199Y=4 925.37X+2 962.420.999 2
    久效磷LC-MS/MS3.00~60Y=14 184.41X-13 024.630.999 6
    涕灭威砜LC-MS/MS10.20~202Y=7 266.57X-25 291.330.999 8
    3-羟基克百威LC-MS/MS5.20~104Y=3 651.39X-9 142.130.998 5
    硫环磷LC-MS/MS3.10~62Y=7 354.36X-5 852.390.999 7
    苯线磷亚砜LC-MS/MS2.05~41Y=655.91X-32.390.999 8
    磷胺LC-MS/MS5.15~103Y=3 005.51X-5 182.820.999 0
    涕灭威LC-MS/MS10.10~202Y=11 866.99X-36 969.070.999 6
    甲磺隆LC-MS/MS4.85~97Y=2 297.70X-1 847.560.999 1
    苯线磷砜LC-MS/MS2.00~40Y=1 208.50X-552.450.997 8
    克百威LC-MS/MS5.05~101Y=11 404.76X-20 949.400.998 8
    氯磺隆LC-MS/MS5.05~101Y=894.56X-339.120.999 7
    甲拌磷亚砜LC-MS/MS2.05~41Y=10 206.115X-5 030.100.999 8
    胺苯磺隆LC-MS/MS5.00~100Y=4 500.82X-6 147.150.998 6
    内吸磷LC-MS/MS2.10~42Y=6 926.58X-4 823.800.999 3
    特丁硫磷LC-MS/MS2.00~40Y=16 908.79X-7 218.660.999 8
    甲拌磷砜LC-MS/MS1.95~39Y=451.97X-397.400.995 4
    水胺硫磷LC-MS/MS5.05~101Y=13 593.18X-18 646.430.999 7
    苯线磷LC-MS/MS2.00~40Y=3 783.93X-1 458.190.999 3
    灭线磷LC-MS/MS2.05~41Y=6 444.63X-3 624.020.999 5
    特丁硫磷砜LC-MS/MS2.10~42Y=947.36X+163.480.998 7
    氯唑磷LC-MS/MS1.00~20Y=11 742.40X-2 819.510.999 6
    硫线磷LC-MS/MS2.00~40Y=9 943.19X-7 358.470.999 3
    甲基异柳磷LC-MS/MS2.10~42Y=20 034.52X-18 536.680.999 2
    地虫硫磷LC-MS/MS2.05~41Y=581.22X-921.560.999 5
    蝇毒磷LC-MS/MS5.05~101Y=527.96X-760.590.999 8
    治螟磷LC-MS/MS2.05~41Y=9 943.19X-7 358.470.999 3
    甲拌磷LC-MS/MS2.05~41Y=353.64X-30.700.999 2
    杀虫脒LC-MS/MS2.10~42Y=1.947 933X+0.014 0930.995 3
    α-六六六GC-MS/MS4.95~99Y=4.880 537X-0.007 8510.998 8
    特丁硫磷GC-MS/MS2.10~42Y=9.683 112X-0.016 6380.996 1
    β-六六六GC-MS/MS4.90~98Y=4.061 750X-0.031 0090.997 1
    氟甲腈GC-MS/MS2.15~43Y=2.987 868X+0.007 8710.998 7
    γ-六六六GC-MS/MS4.70~94Y=3.840 197X+0.053 6110.997 2
    δ-六六六GC-MS/MS4.75~95Y=5.344 570X-0.013 9350.998 1
    艾氏剂GC-MS/MS4.75~95Y=1.527 440X+0.001 4310.998 8
    甲基对硫磷GC-MS/MS1.90~38Y=3.734 819X+0.029 2430.999 5
    氟虫腈硫化物GC-MS/MS2.00~40Y=5.988 870X+0.002 5750.997 3
    氟虫腈GC-MS/MS2.10~42Y=3.631 274X-0.019 0630.998 4
    对硫磷GC-MS/MS2.00~40Y=1.428 485X-0.010 1800.999 6
    三氯杀螨醇GC-MS/MS5.00~100Y=9.069 256X-0.030 6260.998 2
    α-硫丹GC-MS/MS5.20~104Y=0.695 002X+0.006 0660.999 4
    氟虫腈砜GC-MS/MS1.95~39Y=2.529 407X-0.031 9480.994 6
    4,4'-滴滴伊GC-MS/MS4.70~94Y=11.689 424X-0.043 8650.999 0
    狄氏剂GC-MS/MS5.15~103Y=1.010 844X-0.010 7620.999 0
    除草醚GC-MS/MS5.10~102Y=1.658 219X-0.009 2270.997 3
    2,4'-滴滴涕GC-MS/MS4.90~98Y=12.444 953X-0.117 270.998 4
    4,4'-滴滴滴GC-MS/MS4.75~95Y=6.152 856X+0.000 80.999 6
    β-硫丹GC-MS/MS4.90~98Y=0.629 329X-0.002 0750.998 3
    4,4'-滴滴涕GC-MS/MS4.75~95Y=9.002 096X-0.058 0950.997 6
    硫丹硫酸酯GC-MS/MS4.85~97Y=0.579 655X-0.001 6580.999 7
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    表  8  大黄农药残留检测中33种农药回收率实验

    农药平均回收率(%)RSD(%)农药平均回收率(%)RSD(%)
    甲胺磷65.91.28蝇毒磷65.67.45
    涕灭威亚砜77.21.93治螟磷72.93.57
    久效磷76.32.02甲拌磷64.12.63
    涕灭威砜75.63.98杀虫脒100.83.65
    3-羟基克百威76.94.55α-六六六92.34.71
    硫环磷73.53.09特丁硫磷94.05.08
    苯线磷亚砜85.15.72β-六六六95.24.83
    磷胺80.23.83氟甲腈100.94.63
    涕灭威73.23.03γ-六六六100.23.84
    甲磺隆94.410.26δ-六六六92.62.21
    苯线磷砜80.75.93艾氏剂94.44.55
    克百威78.13.90甲基对硫磷99.94.53
    氯磺隆96.59.18氟虫腈硫化物96.64.88
    甲拌磷亚砜75.74.21氟虫腈94.54.09
    胺苯磺隆74.26.22对硫磷92.15.10
    内吸磷64.14.68三氯杀螨醇87.72.80
    特丁硫磷74.93.43α-硫丹95.65.37
    甲拌磷砜84.12.74氟虫腈砜94.73.63
    水胺硫磷78.54.234,4'-滴滴伊101.24.07
    苯线磷69.65.98狄氏剂99.93.66
    灭线磷68.54.04除草醚94.22.33
    特丁硫磷砜80.54.762,4'-滴滴涕101.34.73
    氯唑磷73.24.824,4'-滴滴滴96.91.12
    硫线磷62.13.13β-硫丹94.26.55
    甲基异柳磷72.14.604,4'-滴滴涕100.93.73
    地虫硫磷65.46.17硫丹硫酸酯97.02.57
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出版历程
  • 收稿日期:  2023-10-30
  • 修回日期:  2024-05-06
  • 网络出版日期:  2024-07-12

大黄的HPLC指纹图谱及禁用农药的残留研究

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202310057
    基金项目:  杭州市卫生科技计划项目(B20210302)
    作者简介:

    毛泽玲,主管中药师,研究方向:中药活性成分及质量标准研究,Tel:15757165880,Email:876231359@qq.com

    通讯作者: 文 波,高级工程师,研究方向:中药质量标准研究,Tel:18067998908,Email:wenborin@126.com

摘要:   目的  建立不同种大黄的HPLC特征指纹图谱和禁用农药残留检测方法,并综合评价其药材质量。  方法  收集3种大黄共20批,采用HPLC法进行分析,流动相为甲醇-0.1 %磷酸溶液;梯度洗脱;柱温35 ℃;检测波长254 nm;流速1.0 ml/min;并对结果进行聚类分析。采用直接提取法,并建立HPLC-串联质谱法,气相色谱-串联质谱法,对不同来源、产地大黄的33种禁用农药进行检测。  结果  掌叶大黄、唐古特大黄、药用大黄3种来源大黄的指纹图谱与其对照指纹图谱的相似度均>0.95,聚类分析将20批大黄样品分为3类。不同产地的大黄样品均未检出33种禁用农药。  结论  3种大黄药材质量差异较大,建立的HPLC指纹图谱和禁用农残的方法稳定、可靠、简便准确,可以为大黄的质量控制评价提供依据。

English Abstract

毛泽玲, 文波. 大黄的HPLC指纹图谱及禁用农药的残留研究[J]. 药学实践与服务. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202310057
引用本文: 毛泽玲, 文波. 大黄的HPLC指纹图谱及禁用农药的残留研究[J]. 药学实践与服务. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202310057
MAO Zeling, WEN Bo. HPLC fingerprint of Radix Rhubarb and forbidden pesticide residues[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202310057
Citation: MAO Zeling, WEN Bo. HPLC fingerprint of Radix Rhubarb and forbidden pesticide residues[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202310057
  • 大黄为蓼科植物掌叶大黄(Rheum palmatum L.)、唐古特大黄(Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.)或药用大黄(Rheum officinale Bail1.)的干燥根和根茎,用于实热积滞便秘、血热吐衄、目赤咽肿、痈肿疔疮、肠痈腹痛、瘀血经闭、产后瘀阻、跌打损伤、湿热痢疾、黄疸尿赤、淋证、水肿以及外治烧烫伤[1]。研究表明,大黄含有蒽醌类、二苯乙烯类、苯丁酮类、多糖类、有机酸类、鞣质和多酚类等化学成分,具有泻下、抗衰老、抗肿瘤、防治心血管系统疾病和降血糖等多种药理作用[2-6]

    大黄主要分布于我国甘肃陇南、临洮、宕县、礼县、武都、华庭、青海海东、玉树、海北、四川阿坝、湖北恩施和重庆奉节等地[7-8]。近年来,大黄市场需求量逐渐增加,野生药材逐渐枯竭,家种大黄已经成为市场主流商品。但由于种植环境、种植技术水平差异较大,导致药材质量参差不齐,建立一套整体、全面的大黄药材质量控制方法尤为重要[9-12]

    本研究收集3种来源的20批大黄样品,建立大黄的HPLC指纹图谱并进行方法学考察。建立了检测大黄中33种禁用农药残留的方法并进行方法学考察,为更充分利用大黄药材资源提供实验基础。

    • SHIMADZU 20AT HPLC仪(日本岛津公司);XS105万分之一分析天平[Mettler-Toledo international trading(Shanghai)co., Ltd.];电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)。Agilent 1260-6470 QQQ三重四极杆质谱仪,Agilent 8890-7000D气相色谱仪-三重串联四极杆质谱仪;LC-SFJ-10型手持高速匀浆机;GIPP型水浴氮吹仪;RG-160AT型离心机;Direct-Q3UV型超纯水机;XS105型电子天平;RE-52A型旋转蒸发仪;Vortex-250OMT型多管旋涡混合仪;WSZ-200A型振荡器。

    • 芦荟大黄素对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110795-202011,纯度:97.5%),大黄素甲醚对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110758-201817,纯度:99.2%),大黄酚对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110796-201922,纯度:99.4%),大黄素对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110756-201913,纯度:96.0%),禁用农药混合对照溶液(中国食品药品检定研究院,批号:610020-202202),甲醇为分析纯(杭州高晶精细化工有限公司);磷酸为分析纯(天津市科密欧化学试剂有限公司);色谱纯乙腈 、甲醇(上海星可高纯溶剂有限公司);其余试剂均为分析纯。

    • 20批大黄药材分别采集于甘肃、青海、四川、湖北,大黄药材经嘉兴东方国药饮片股份有限公司朱涛副主任药师鉴定为蓼科大黄属植物掌叶大黄、唐古特大黄和药用大黄的干燥根和根茎,见表1

      表 1  20批大黄采集信息表

      编号来源产地采集时间
      1唐古特大黄青海海东2021年9月
      2唐古特大黄青海海东2021年9月
      3唐古特大黄青海玉树2021年9月
      4唐古特大黄青海玉树2021年9月
      5唐古特大黄青海玉树2021年9月
      6药用大黄四川绵阳2021年9月
      7药用大黄四川绵阳2021年9月
      8药用大黄四川阿坝州2021年9月
      9药用大黄湖北恩施州2021年9月
      10药用大黄四川阿坝州2021年9月
      11药用大黄湖北恩施州2021年9月
      12药用大黄四川阿坝州2021年9月
      13掌叶大黄甘肃陇南2021年9月
      14掌叶大黄甘肃陇南2021年9月
      15掌叶大黄甘肃陇南2021年9月
      16掌叶大黄甘肃宕县2021年9月
      17掌叶大黄甘肃宕县2021年9月
      18掌叶大黄甘肃礼县2021年9月
      19掌叶大黄甘肃礼县2021年9月
      20掌叶大黄甘肃礼县2021年9月
    • 精密称取大黄粉末0.5 g(过四号筛),置具塞锥形瓶中,精密加入25 ml分析纯甲醇,称定重量,水浴加热回流1 h,放冷,用分析纯甲醇补足减失的重量,过0.45 μm微孔滤膜,取续滤液,即得。

    • 精密称取芦荟大黄素对照品、大黄素甲醚对照品、大黄酚对照品、大黄素对照品适量,加色谱纯甲醇制成每1 ml含芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、大黄素各16 μg的混合溶液,摇匀,备用。

    • 色谱柱:Silversil C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm);以色谱纯甲醇为流动相A,以0.1 %磷酸溶液为流动相B,按照表2进行梯度洗脱;流速为1.0 ml/min;检测波长为254 nm;柱温为35 ℃;进样量为10 μl。

      表 2  梯度洗脱条件

      时间(t/min)流动相(A)流动相(B)
      0.01090
      5.02575
      45.06040
      60.07030
      70.08020
      90.08020
      90.11090
      100.11090
    • (1)空白试验

      吸取分析纯甲醇,在“2.1.3”色谱条件下测定,未见干扰。

      (2)精密度考察

      按“2.1.1”项下方法制备编号为1的掌叶大黄供试品溶液,按“2.1.3”色谱条件,连续进样6 次 ,记录液相色谱图,计算精密度。以9号峰(芦荟大黄素)为参照峰,各共有峰保留时间的RSD值为0.02 %~0.04 %,峰面积的RSD值范围为0.04 %~0.73 %,均小于2 %。表明仪器精密度良好。

      (3)稳定性考察

      取编号为1的掌叶大黄,按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液,放置0、2、4、6、8、10、12 h并按“2.1.3”色谱条件进样,以9号峰(芦荟大黄素)为参照峰,各共有峰保留时间的RSD值为0.02 %~0.04 %,峰面积的RSD值范围为0.32 %~1.70 %,均小于2 %,表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

      (4)重复性考察

      取编号为1的掌叶大黄,按“2.1.1”项下方法制备 6 份供试品溶液,按“2.1.3”色谱条件进样测定,以9号峰(芦荟大黄素)为参照峰,各共有峰相对保留时间的RSD值范围为0.03 %~0.07 %,峰面积的RSD值范围为0.45 %~1.54 %, RSD值均小于2 %,表明该方法重复性良好。

    • 取不同来源的大黄样品20批(表1),按“2.1”项下方法制备大黄供试品溶液并进样测定,得到20批大黄样品色谱图,图谱显示掌叶大黄、唐古特大黄、药用大黄3种来源大黄的液相色谱图差异较大,每个来源大黄的色谱图之间差异较小,将色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”,共标定12个共有特征峰,分别以每个来源样品的色谱图为参照图谱,采用中位数法,时间窗宽度为0.1,得到3种来源大黄的HPLC对照图谱,见图1图2。相似度评价结果见表3表5。大黄样品与其对照指纹图谱的相似度均>0.95,说明同一来源大黄样品的质量比较接近。

      图  1  20批大黄叠加指纹图谱

      图  2  混合对照品及3种基原大黄对照图谱

      表 3  掌叶大黄相似度结果

      序号S1S2S3S4S5S6S7S8对照
      S11.0000.9690.9930.9890.9800.9760.9950.9860.991
      S20.9691.0000.9890.9930.9930.9890.9860.9930.993
      S30.9930.9891.0000.9970.9930.9900.9980.9980.999
      S40.9890.9930.9971.0000.9970.9860.9960.9960.998
      S50.9800.9930.9930.9971.0000.9820.9890.9940.995
      S60.9760.9890.9900.9860.9821.0000.9890.9930.992
      S70.9950.9860.9980.9960.9890.9891.0000.9960.998
      S80.9860.9930.9980.9960.9940.9930.9961.0000.999
      对照0.9910.9930.9990.9980.9950.9920.9980.9991.000

      表 4  唐古特大黄相似度结果

      序号 S1 S2 S3 S4 S5 对照
      S1 1.000 0.992 0.987 0.996 0.990 0.996
      S2 0.992 1.000 0.992 0.994 0.994 0.997
      S3 0.987 0.992 1.000 0.987 0.998 0.996
      S4 0.996 0.994 0.987 1.000 0.994 0.997
      S5 0.990 0.994 0.998 0.994 1.000 0.998
      对照 0.996 0.997 0.996 0.997 0.998 1.000

      表 5  药用大黄相似度结果

      序号S1S2S3S4S5S6S7对照
      S11.0000.9840.9640.9960.9780.9920.9780.996
      S20.9841.0000.9120.9800.9510.9940.9770.986
      S30.9640.9121.0000.9750.9770.9380.9410.964
      S40.9960.9800.9751.0000.9870.9900.9830.998
      S50.9780.9510.9770.9871.0000.9760.9840.987
      S60.9920.9940.9380.9900.9761.0000.9900.996
      S70.9780.9770.9410.9830.9840.9901.0000.991
      对照0.9960.9860.9640.9980.9870.9960.9911.000
    • 根据保留时间比对确定共有指纹峰,对20批大黄HPLC指纹图谱测定结果进行比较分析,确定12个共有指纹峰。通过与对照品的保留时间比对,确定大黄图谱9号峰为芦荟大黄素, 10号峰为大黄素,11号峰为大黄酚,12号峰为大黄素甲醚。

    • 采用组间联接法,以峰面积为变量,用SPSS 26.0软件对20批大黄进行聚类分析。由聚类分析树状图可知, 20批不同样品可聚为3类,5批唐古特大黄S1 、S2 、S3 、S4、S5聚为一类,药用大黄S6、S7、S9、S11聚为一类,药用大黄S8、S10、S12、掌叶大黄S13、S14、S15、S16、S17、S18、S19、S20聚合为一类。聚类分析树状图见图3

      图  3  大黄样品聚类分析树状图

    • 参照《中国药典2020年版》四部2341农药残留量测定法测定。

    • (1)气相色谱质谱条件

      色谱条件:用(50%苯基)-甲基聚硅氧烷为固定液的弹性石英毛细管柱(柱长30 m,膜厚度0.25 µm,柱内径0.25 mm)。进样口温度为250 ℃,不分流进样。载气为高纯氦气。进样口为恒压模式,柱前压力为146 kPa。程序升温:设定初始温度为60 ℃,保持1 min,以30 ℃/min升至120 ℃,再以10 ℃/min升至160 ℃,再以2 ℃/min的速率升温至230 ℃,最后以15 ℃/min升温至300 ℃,保持6 min。

      质谱条件:以三重四极杆串联质谱仪检测;离子源为电子轰击源,离子源温度250 ℃。碰撞气为氮气。质谱传输接口温度280 ℃。质谱监测模式为多反应监测。

      (2)液相色谱质谱条件

      色谱条件:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长10 cm,粒径2.6 µm,内径2.1 mm);以0.1 %甲酸溶液(含5 mmol/L甲酸铵)为流动相A,以乙腈-0.1%甲酸溶液(含5 mmol/L甲酸铵)(95∶5)为流动相B,按下表6进行梯度洗脱;流速为0.3 ml/min,柱温为40 ℃。

      表 6  流动相梯度洗脱程序

      时间(t/min)流动相A(%)流动相B(%)
      0~17030
      1~1270→030→100
      12~140100

      质谱条件:以三重四极杆串联质谱仪检测;离子源为电喷雾离子源,正离子扫描模式。监测模式为多反应监测。

    • (1) 提取

      取过三号筛的大黄粉末5 g,精密称定,加1 g氯化钠,立即摇散,再加入50 ml乙腈,匀浆处理2 min(转速不低于12 000 r/min),再至4 000 r/min的离心机中离心,取上清液,剩余沉淀再加50 ml乙腈,匀浆处理1 min,再离心,合并两次提取的上清液,减压浓缩至约5 ml,用乙腈稀释至10 ml,摇匀,即得。

      (2)净化

      ①气相色谱-串联质谱法:量取乙腈:甲苯(3∶1)10 ml过SelectCore GCB/NH2-A固相萃取柱 (500 mg/500 mg/6 ml)(纳谱分析)活化,溶液弃去,精密量取“提取”中制备的供试品溶液2 ml置萃取柱上,待萃取小柱中样品液全部通过,用20 ml乙腈:甲苯(3∶1)洗脱,收集全部洗脱液,40 ℃以下减压回收至近干,用乙腈稀释至2.0 ml,混匀,即得。②高效液相色谱-串联质谱法:量取上述供试品溶液3 ml,通过亲水亲油平衡材料SelectCore HLB-B固相萃取柱(200 mg,6 ml)(纳谱分析)净化,收集全部净化液,即得。

    • (1)混合对照品溶液的制备

      取已知浓度的禁用农药混合对照品溶液(已标示各相关农药品种的浓度),精密量取1 ml,置20 ml容量瓶中,用乙腈稀释至刻度,摇匀,即得。

      (2)气相色谱-串联质谱法分析用内标溶液的制备

      精密称取磷酸三苯酯对照品适量,精密称定,加乙腈溶解并制溶解并制成每1 ml含l.0 mg的溶液。精密量取适量,加乙腈制成每1 ml含0.1 µg的溶液。

      (3)空白基质溶液的制备

      取不含农残的空白大黄基质样品,同供试品溶液的制备方法处理,得到空白基质溶液。

      (4)基质混合对照溶液的制备

      精密量取上述空白基质溶液1.0 ml(6份),置40 ℃水浴氮吹仪上,氮吹浓缩至约0.6 ml,分别加入混合对照品溶液10、20、50、100、150、200 µl,加乙腈稀释至1 ml,混匀,即得。

    • (1)气相色谱-串联质谱法

      分别精密吸取上述的供试品溶液和基质混合对照溶液各1 ml,分别精密加入内标溶液0.3 ml,混匀过滤,取续滤液。分别精密吸取上述两种溶液各1 µl,注入仪器,按内标曲线法计算,即得。

      (2)高效液相色谱-串联质谱法

      分别精密吸取上述的基质混合对照溶液和供试品溶液各1 ml,精密加入水0.3 ml,混匀过滤,取续滤液。分别精密吸取上述两种溶液各1 µl,注入仪器,按外标曲线法计算,即得。

    • (1)标准曲线

      将33种禁用农药的基质混合溶液,按照“2.3.4”项下方法进行测定,以不同农药的质量浓度为横坐标,对应的响应值为纵坐标,绘制工作曲线。结果表明:33种禁用农药的质量浓度在线性范围内与其对应的响应值呈线性关系,线性参数表见表7

      表 7  线性参数表

      农药测定方法线性范围(µg/L)线性回归方程相关系数
      甲胺磷LC-MS/MS5.10~102Y=5 757.95X-9 518.720.999 7
      涕灭威亚砜LC-MS/MS9.95~199Y=4 925.37X+2 962.420.999 2
      久效磷LC-MS/MS3.00~60Y=14 184.41X-13 024.630.999 6
      涕灭威砜LC-MS/MS10.20~202Y=7 266.57X-25 291.330.999 8
      3-羟基克百威LC-MS/MS5.20~104Y=3 651.39X-9 142.130.998 5
      硫环磷LC-MS/MS3.10~62Y=7 354.36X-5 852.390.999 7
      苯线磷亚砜LC-MS/MS2.05~41Y=655.91X-32.390.999 8
      磷胺LC-MS/MS5.15~103Y=3 005.51X-5 182.820.999 0
      涕灭威LC-MS/MS10.10~202Y=11 866.99X-36 969.070.999 6
      甲磺隆LC-MS/MS4.85~97Y=2 297.70X-1 847.560.999 1
      苯线磷砜LC-MS/MS2.00~40Y=1 208.50X-552.450.997 8
      克百威LC-MS/MS5.05~101Y=11 404.76X-20 949.400.998 8
      氯磺隆LC-MS/MS5.05~101Y=894.56X-339.120.999 7
      甲拌磷亚砜LC-MS/MS2.05~41Y=10 206.115X-5 030.100.999 8
      胺苯磺隆LC-MS/MS5.00~100Y=4 500.82X-6 147.150.998 6
      内吸磷LC-MS/MS2.10~42Y=6 926.58X-4 823.800.999 3
      特丁硫磷LC-MS/MS2.00~40Y=16 908.79X-7 218.660.999 8
      甲拌磷砜LC-MS/MS1.95~39Y=451.97X-397.400.995 4
      水胺硫磷LC-MS/MS5.05~101Y=13 593.18X-18 646.430.999 7
      苯线磷LC-MS/MS2.00~40Y=3 783.93X-1 458.190.999 3
      灭线磷LC-MS/MS2.05~41Y=6 444.63X-3 624.020.999 5
      特丁硫磷砜LC-MS/MS2.10~42Y=947.36X+163.480.998 7
      氯唑磷LC-MS/MS1.00~20Y=11 742.40X-2 819.510.999 6
      硫线磷LC-MS/MS2.00~40Y=9 943.19X-7 358.470.999 3
      甲基异柳磷LC-MS/MS2.10~42Y=20 034.52X-18 536.680.999 2
      地虫硫磷LC-MS/MS2.05~41Y=581.22X-921.560.999 5
      蝇毒磷LC-MS/MS5.05~101Y=527.96X-760.590.999 8
      治螟磷LC-MS/MS2.05~41Y=9 943.19X-7 358.470.999 3
      甲拌磷LC-MS/MS2.05~41Y=353.64X-30.700.999 2
      杀虫脒LC-MS/MS2.10~42Y=1.947 933X+0.014 0930.995 3
      α-六六六GC-MS/MS4.95~99Y=4.880 537X-0.007 8510.998 8
      特丁硫磷GC-MS/MS2.10~42Y=9.683 112X-0.016 6380.996 1
      β-六六六GC-MS/MS4.90~98Y=4.061 750X-0.031 0090.997 1
      氟甲腈GC-MS/MS2.15~43Y=2.987 868X+0.007 8710.998 7
      γ-六六六GC-MS/MS4.70~94Y=3.840 197X+0.053 6110.997 2
      δ-六六六GC-MS/MS4.75~95Y=5.344 570X-0.013 9350.998 1
      艾氏剂GC-MS/MS4.75~95Y=1.527 440X+0.001 4310.998 8
      甲基对硫磷GC-MS/MS1.90~38Y=3.734 819X+0.029 2430.999 5
      氟虫腈硫化物GC-MS/MS2.00~40Y=5.988 870X+0.002 5750.997 3
      氟虫腈GC-MS/MS2.10~42Y=3.631 274X-0.019 0630.998 4
      对硫磷GC-MS/MS2.00~40Y=1.428 485X-0.010 1800.999 6
      三氯杀螨醇GC-MS/MS5.00~100Y=9.069 256X-0.030 6260.998 2
      α-硫丹GC-MS/MS5.20~104Y=0.695 002X+0.006 0660.999 4
      氟虫腈砜GC-MS/MS1.95~39Y=2.529 407X-0.031 9480.994 6
      4,4'-滴滴伊GC-MS/MS4.70~94Y=11.689 424X-0.043 8650.999 0
      狄氏剂GC-MS/MS5.15~103Y=1.010 844X-0.010 7620.999 0
      除草醚GC-MS/MS5.10~102Y=1.658 219X-0.009 2270.997 3
      2,4'-滴滴涕GC-MS/MS4.90~98Y=12.444 953X-0.117 270.998 4
      4,4'-滴滴滴GC-MS/MS4.75~95Y=6.152 856X+0.000 80.999 6
      β-硫丹GC-MS/MS4.90~98Y=0.629 329X-0.002 0750.998 3
      4,4'-滴滴涕GC-MS/MS4.75~95Y=9.002 096X-0.058 0950.997 6
      硫丹硫酸酯GC-MS/MS4.85~97Y=0.579 655X-0.001 6580.999 7

      (2)回收率和重复性实验

      以空白大黄样品6份为基质,分别加入混合对照品溶液200 µl到样品中,做加标回收试验,根据实际曲线得到的响应值结果与理论值进行计算33种禁用农药的回收率和回收率的相对标准偏差(RSD)。结果表明:33种禁用农药的平均回收率为62.1%~101.3% ,回收率的 RSD为1.12%~10.26%。结果见表8

      表 8  大黄农药残留检测中33种农药回收率实验

      农药平均回收率(%)RSD(%)农药平均回收率(%)RSD(%)
      甲胺磷65.91.28蝇毒磷65.67.45
      涕灭威亚砜77.21.93治螟磷72.93.57
      久效磷76.32.02甲拌磷64.12.63
      涕灭威砜75.63.98杀虫脒100.83.65
      3-羟基克百威76.94.55α-六六六92.34.71
      硫环磷73.53.09特丁硫磷94.05.08
      苯线磷亚砜85.15.72β-六六六95.24.83
      磷胺80.23.83氟甲腈100.94.63
      涕灭威73.23.03γ-六六六100.23.84
      甲磺隆94.410.26δ-六六六92.62.21
      苯线磷砜80.75.93艾氏剂94.44.55
      克百威78.13.90甲基对硫磷99.94.53
      氯磺隆96.59.18氟虫腈硫化物96.64.88
      甲拌磷亚砜75.74.21氟虫腈94.54.09
      胺苯磺隆74.26.22对硫磷92.15.10
      内吸磷64.14.68三氯杀螨醇87.72.80
      特丁硫磷74.93.43α-硫丹95.65.37
      甲拌磷砜84.12.74氟虫腈砜94.73.63
      水胺硫磷78.54.234,4'-滴滴伊101.24.07
      苯线磷69.65.98狄氏剂99.93.66
      灭线磷68.54.04除草醚94.22.33
      特丁硫磷砜80.54.762,4'-滴滴涕101.34.73
      氯唑磷73.24.824,4'-滴滴滴96.91.12
      硫线磷62.13.13β-硫丹94.26.55
      甲基异柳磷72.14.604,4'-滴滴涕100.93.73
      地虫硫磷65.46.17硫丹硫酸酯97.02.57
    • 按照以上前处理方法对20批大黄样品进行测定,检测结果表明禁用农药均未检出。本研究显示该方法快速、高效和准确,可以作为日常药材监管和检验依据,对大黄中农药残留进行安全评估。

    • 本研究建立了20批不同产地不同种源大黄的指纹图谱,采用指纹图谱软件共标定出12个共有指纹峰。通过与对照品的色谱峰保留时间比对,4个色谱峰得到确认。生成3种不同来源大黄的指纹图谱,每一类大黄与其对照指纹图谱的相似度均大于0.95,说明建立的大黄指纹图谱方法具有较好的稳定性和可控性,能为质量评价提供参考依据。通过聚类分析将20批大黄分为3类,5批唐古特大黄S1 、S2 、S3 、S4、S5聚为一类,药用大黄S6、S7、S9、S11聚为一类,药用大黄S8、S10、S12、掌叶大黄S13、S14、S15、S16、S17、S18、S19、S20聚合为一类,表明大黄药材的内在质量与大黄种属有一定的关联,可能还与产地,海拔,种植环境有关。综上所述,本研究所建立的不同来源大黄指纹图谱准确度高,灵敏度高,专属性强,可以为大黄的质量控制提供可靠依据。同时本研究建立了大黄中33种禁用农药检测方法,结果显示所有大黄样品均未检出禁用农药,风险较小。结果显示,该方法操作简单、重复性好,可用于大黄的禁用农药残留筛查。

参考文献 (12)

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