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应中央军委要求,2022年9月起,《药学实践杂志》将更名为《药学实践与服务》,双月刊,正文96页;2023年1月起,拟出版月刊,正文64页,数据库收录情况与原《药学实践杂志》相同。欢迎作者踊跃投稿!

HPLC-ELSD法同时测定知母药材中5种成分的含量

戴建英 尤巍 田甜 洪战英

戴建英, 尤巍, 田甜, 洪战英. HPLC-ELSD法同时测定知母药材中5种成分的含量[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(1): 34-37. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202109070
引用本文: 戴建英, 尤巍, 田甜, 洪战英. HPLC-ELSD法同时测定知母药材中5种成分的含量[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(1): 34-37. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202109070
DAI Jianying, YOU Wei, TIAN Tian, HONG Zhanying. Simultaneous determination of five components in Anemarrhenae Rhizoma by HPLC-ELSD[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(1): 34-37. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202109070
Citation: DAI Jianying, YOU Wei, TIAN Tian, HONG Zhanying. Simultaneous determination of five components in Anemarrhenae Rhizoma by HPLC-ELSD[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(1): 34-37. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202109070

HPLC-ELSD法同时测定知母药材中5种成分的含量

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202109070
基金项目: 国家自然科学基金项目(81673386、81872829)
详细信息
    作者简介:

    戴建英,硕士研究生,研究方向:中药活性成分和代谢组学研究,Email:1327170885@qq.com,Tel:15205030253

    通讯作者: 洪战英,教授,研究方向:中药化学物质组与代谢组学研究,Email:hongzhy001@163.com,Tel:(021)81871269
  • 中图分类号: R284.1

Simultaneous determination of five components in Anemarrhenae Rhizoma by HPLC-ELSD

  • 摘要:   目的  采用高效液相色谱-蒸发光散射检测方法(HPLC-ELSD)建立同时测定知母药材中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ及知母皂苷AⅢ的含量测定方法。  方法  采用Agilent poroshell 120 EC-C18柱,流动相采用乙腈-0.2%醋酸水系统,梯度洗脱;柱温为30 ℃,流速为0.7 ml/min;蒸发光散射检测器以氮气为雾化气,雾化气温度为40 ℃,漂移管温度为90 ℃,氮气体积流量为2.0 L/min;进样量为20 μl。  结果  5种成分均能达到基线分离,新芒果苷24.1~386 μg/ml(r=0.999 3)、芒果苷23.2~371 μg/ml(r=0.998 6)、知母皂苷BⅡ 54.2~867.2 μg/ml(r=0.995 6)、宝藿苷Ⅰ 5.3~84.8 μg/ml(r=0.996 8)、知母皂苷AⅢ 10~160 μg/ml(r=0.998 9)的浓度范围内呈现良好的线性关系。5种成分的平均加样回收率在101.8%~105.0%之间,重复性RSD小于2.4%,知母药材中上述5种成分含量分别为1.62%、0.82%、7.36%、0.07%、0.34%。  结论  该方法操作简便、准确、灵敏度高,可用于知母药材的多指标成分定量测定。
  • 图  1  知母混合对照品(A)和样品(B)的HPLC-ELSD色谱图

    1.新芒果苷;2.芒果苷;3.知母皂苷BⅡ;4.宝藿苷Ⅰ;5.知母皂苷AⅢ。

    图  2  不同流动相系统对新芒果苷(1)和芒果苷(2)的影响

    A. 乙腈-水;B. 乙腈-0.2%醋酸水溶液。

    图  3  漂移管温度对待测物质响应值的影响

    表  1  知母中5种成分线性回归方程和线性范围

    成分回归方程线性范围(μg/ml)r
    新芒果苷lgA=1.8601×lgC−1.687424.1~3860.9993
    芒果苷lgA=1.8445×lgC−1.395523.2~3710.9986
    知母皂苷BⅡlgA=1.43×lgC−0.18454.2~867.20.9956
    宝藿苷ⅠlgA=1.4974×lgC+0.33645.3~84.80.9968
    知母皂苷AⅢlgA=1.4808×lgC+0.238710~1600.9989
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    表  2  知母中5种成分加样回收率试验结果(n=6)

    成分原有量
    m/mg)
    加入量
    m/mg)
    测得量
    m/mg)
    回收率
    (%)
    平均回收率
    (%)
    RSD
    (%)
    新芒果苷4.064.809.01103.2101.81.5
    4.114.808.99101.9
    4.194.809.07101.8
    3.994.808.87101.8
    4.074.809.04103.5
    4.094.808.8398.69
    芒果苷2.082.134.26102.8102.2

    2.5
    2.102.134.2098.73
    2.142.134.39105.3
    2.042.134.2710.0
    2.082.134.1999.07
    2.092.134.28102.7
    知母皂苷BⅡ18.4510.8029.88105.77104.911.28
    18.6510.829.93104.5
    19.0410.8030.59107.0
    18.1410.8029.55105.6
    18.5010.8029.65103.2
    18.5910.8029.75103.4
    宝藿苷Ⅰ0.170.210.39103.4102.01.8
    0.170.210.39102.2
    0.180.210.39102.6
    0.170.210.39100.9
    0.170.210.3998.57
    0.170.210.39104.1
    知母皂苷AⅢ0.871.172.07103.4103.21.0
    0.881.172.07102.7
    0.901.172.08101.7
    0.861.172.05102.5
    0.871.172.08104.3
    0.881.172.09104.7
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-09-13
  • 修回日期:  2022-01-05
  • 网络出版日期:  2022-01-20
  • 刊出日期:  2022-01-25

HPLC-ELSD法同时测定知母药材中5种成分的含量

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202109070
    基金项目:  国家自然科学基金项目(81673386、81872829)
    作者简介:

    戴建英,硕士研究生,研究方向:中药活性成分和代谢组学研究,Email:1327170885@qq.com,Tel:15205030253

    通讯作者: 洪战英,教授,研究方向:中药化学物质组与代谢组学研究,Email:hongzhy001@163.com,Tel:(021)81871269
  • 中图分类号: R284.1

摘要:   目的  采用高效液相色谱-蒸发光散射检测方法(HPLC-ELSD)建立同时测定知母药材中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ及知母皂苷AⅢ的含量测定方法。  方法  采用Agilent poroshell 120 EC-C18柱,流动相采用乙腈-0.2%醋酸水系统,梯度洗脱;柱温为30 ℃,流速为0.7 ml/min;蒸发光散射检测器以氮气为雾化气,雾化气温度为40 ℃,漂移管温度为90 ℃,氮气体积流量为2.0 L/min;进样量为20 μl。  结果  5种成分均能达到基线分离,新芒果苷24.1~386 μg/ml(r=0.999 3)、芒果苷23.2~371 μg/ml(r=0.998 6)、知母皂苷BⅡ 54.2~867.2 μg/ml(r=0.995 6)、宝藿苷Ⅰ 5.3~84.8 μg/ml(r=0.996 8)、知母皂苷AⅢ 10~160 μg/ml(r=0.998 9)的浓度范围内呈现良好的线性关系。5种成分的平均加样回收率在101.8%~105.0%之间,重复性RSD小于2.4%,知母药材中上述5种成分含量分别为1.62%、0.82%、7.36%、0.07%、0.34%。  结论  该方法操作简便、准确、灵敏度高,可用于知母药材的多指标成分定量测定。

English Abstract

戴建英, 尤巍, 田甜, 洪战英. HPLC-ELSD法同时测定知母药材中5种成分的含量[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(1): 34-37. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202109070
引用本文: 戴建英, 尤巍, 田甜, 洪战英. HPLC-ELSD法同时测定知母药材中5种成分的含量[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(1): 34-37. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202109070
DAI Jianying, YOU Wei, TIAN Tian, HONG Zhanying. Simultaneous determination of five components in Anemarrhenae Rhizoma by HPLC-ELSD[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(1): 34-37. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202109070
Citation: DAI Jianying, YOU Wei, TIAN Tian, HONG Zhanying. Simultaneous determination of five components in Anemarrhenae Rhizoma by HPLC-ELSD[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(1): 34-37. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202109070
  • 中药知母(Anemarrhenae rhizoma)为百合科植物知母(Anemarrhena asphodeloides Bge.)的干燥根茎,始载于《神农本草经》,具有清热泻火,肺热燥咳,滋阴润燥以及肠燥便秘等作用[1]。知母根茎中含有甾体皂苷类、黄酮类、双苯吡酮类、木质素类、多糖类和生物碱类等多种成分,甾体皂苷类是其首要药理活性成分。其中新芒果苷、芒果苷等黄酮苷类单体成分具有降低血糖的作用,知母皂苷BⅡ以及知母皂苷AⅢ等甾体皂苷类单体成分具有改善学习记忆、抗老年痴呆的作用[2]

    《中国药典》(2020年版)将芒果苷和知母皂苷BⅡ作为知母的质量评价指标[3],目前知母中芒果苷和新芒果苷的含量测定方法多采用高效液相-紫外检测法,而知母中另外一类重要的活性成分甾体皂苷类,由于不存在共轭结构、缺少紫外吸收,需通过衍生化技术将其转化成有紫外特征吸收的物质;但这种操作复杂、耗时,且准确度受衍生物稳定性的影响较大[4-5],因此紫外检测器并不适用于甾体皂苷类物质的检测。相比于紫外检测器,蒸发光散射检测器(ELSD)不要求化合物带有发色团或荧光基团,能够测定没有紫外吸收或为紫外末端弱吸收的样品;而且可以在多溶剂梯度的情况下获得稳定的基线和较高的分辨率。目前,已有应用HPLC-ELSD法对知母药材中单种成分或多成分含量测定的报道[6-7],但是所建立的方法往往分析时间较长,消耗试剂较多。

    本文建立了一种快速、简便、准确的HPLC-ELSD方法,可同时测定知母中3个黄酮类成分(新芒果苷、芒果苷、宝藿苷Ⅰ)和2个甾体皂苷类成分(知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ)的含量,可为知母药材质量控制提供参考依据。

    • 高效液相色谱仪(1260 InfinityⅡ Prime LC, 美国安捷伦公司);蒸发光散射检测器(G4260B,美国安捷伦公司);分析天平(XS205,梅特勒-托利多国际公司)、涡旋混合器(SCILOGEX MX-S,美国Scilogex公司)、超声波清洗器(2300TH型,上海安谱实验科技股份有限公司)。

    • 新芒果苷对照品(批号:3671)、芒果苷对照品(批号:5586)、知母皂苷BⅡ对照品(批号:1369)、宝藿苷Ⅰ对照品(批号:1869)、知母皂苷AⅢ对照品(批号:3892)购自上海诗丹德标准技术服务有限公司;知母药材由上海市食品药品检验所中药室赠予;色谱纯乙腈(北京迪科马科技有限公司);色谱纯异丙醇(上海安谱实验科技股份有限公司);分析纯乙醇和乙酸(国药集团化学试剂有限公司)。

    • 精密称取芒果苷、新芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ和知母皂苷AⅢ 对照品适量,置于5 ml容量瓶中,加50%乙醇溶液适量,超声溶解后,加入50%乙醇稀释并定容得到混合溶液,精密量取1 ml该混合溶液置于5 ml容量瓶中,加50%乙醇溶液定容,最终得含芒果苷464 μg/ml,新芒果苷482 μg/ml,知母皂苷BⅡ 1084 μg/ml,宝藿苷Ⅰ 106 μg/ml,知母皂苷AⅢ 200 μg/ml的混合对照品储备液,摇匀备用。

    • 取知母药材适量,干燥后粉碎,过3号筛得知母药材粉末。取药材粉末0.5 g,精密称定,置于50 ml具塞锥形瓶中,精密加入50%乙醇50 ml,称重,超声(功率300 W,60 Hz)处理30 min。超声结束后放置至室温后再次称定质量,使用50%乙醇补足所减失的质量,摇匀后滤过。取续滤液过0.22 μm微孔滤膜,作为供试品溶液。

    • 色谱柱为Agilent poroshell 120 EC-C18柱(2.1×100 mm,2.7 μm);流动相为乙腈(A)-0.2%醋酸水(B);梯度洗脱程序设定为0~3 min,4%~10%A;3~5 min,10%A;5~7 min,20%A;7~11 min,20%~25%A;11~14 min,25%~90%A;14~18 min,90%A;18~19 min,90%~4%A;19~20 min,90%~4%A。柱温为30 ℃;流速为0.7 ml/min。蒸发光散射器的参数设定雾化气温度为40 ℃;漂移管温度为90 ℃;氮气体积流量为2.0 ml/min。供试品进样量为20 μl。混合对照品和供试品色谱图见图1,新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ 的保留时间分别为4.05、5.49、11.63、13.85、14.38 min,各成分之间分离度均>1.5。

      图  1  知母混合对照品(A)和样品(B)的HPLC-ELSD色谱图

    • 精密量取1.6 ml混合对照品储备液和0. 4 ml 50%乙醇溶液,涡旋30 s混匀,后使用50%乙醇依次对半稀释。按上述色谱条件进行测定,以峰面积(A)的对数值与进样浓度(C)的对数值进行线性回归,考察结果见表1,表明知母中各成分在相应的浓度范围内均呈现良好的线性关系。

      表 1  知母中5种成分线性回归方程和线性范围

      成分回归方程线性范围(μg/ml)r
      新芒果苷lgA=1.8601×lgC−1.687424.1~3860.9993
      芒果苷lgA=1.8445×lgC−1.395523.2~3710.9986
      知母皂苷BⅡlgA=1.43×lgC−0.18454.2~867.20.9956
      宝藿苷ⅠlgA=1.4974×lgC+0.33645.3~84.80.9968
      知母皂苷AⅢlgA=1.4808×lgC+0.238710~1600.9989
    • 精密吸取混合对照品20 μl,按上述色谱条件连续进样6次,计算5种成分峰面积的RSD值,结果显示,新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的RSD分别为1.3%、1.0%、0.9%、1.5%、1.0%、1.4%,表明仪器精密度良好。

    • 称取知母药材粉末0.5 g,精密称定,平行称取6份,按上述操作制备供试品溶液,进样测定,计算新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的含量分别为1.62%、0.82%、7.36%、0.07%、0.34%,RSD分别为1.8%、1.8%、1.4%、2.2%、2.4%,显示方法重复性良好。

    • 称取知母药材粉末0.5 g,按上述操作制备供试品溶液,分别于制备后0、2、4、6、8、12 h进样测定,结果显示新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的峰面积RSD分别为:2.3%、1.3%、0.9%、3.1%、1.8%,说明样品在12 h内稳定。

    • 称取知母药材粉末0.25 g,精密称定,平行称取6份,分别加入与知母药材粉末各成分含量相近的混合对照品溶液,按上述操作制备供试品溶液,进样测定,计算加样回收率。结果见表2,知母中5种成分的平均回收率为101.8%~105.0%,表明该方法准确度良好。

      表 2  知母中5种成分加样回收率试验结果(n=6)

      成分原有量
      m/mg)
      加入量
      m/mg)
      测得量
      m/mg)
      回收率
      (%)
      平均回收率
      (%)
      RSD
      (%)
      新芒果苷4.064.809.01103.2101.81.5
      4.114.808.99101.9
      4.194.809.07101.8
      3.994.808.87101.8
      4.074.809.04103.5
      4.094.808.8398.69
      芒果苷2.082.134.26102.8102.2

      2.5
      2.102.134.2098.73
      2.142.134.39105.3
      2.042.134.2710.0
      2.082.134.1999.07
      2.092.134.28102.7
      知母皂苷BⅡ18.4510.8029.88105.77104.911.28
      18.6510.829.93104.5
      19.0410.8030.59107.0
      18.1410.8029.55105.6
      18.5010.8029.65103.2
      18.5910.8029.75103.4
      宝藿苷Ⅰ0.170.210.39103.4102.01.8
      0.170.210.39102.2
      0.180.210.39102.6
      0.170.210.39100.9
      0.170.210.3998.57
      0.170.210.39104.1
      知母皂苷AⅢ0.871.172.07103.4103.21.0
      0.881.172.07102.7
      0.901.172.08101.7
      0.861.172.05102.5
      0.871.172.08104.3
      0.881.172.09104.7
    • 称取知母药材粉末0.5 g,精密称定,按上述操作进样测定,计算各成分含量,最终计算得新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的平均含量分别为1.62%、0.82%、7.36%、0.07%、0.34%。

    • 本研究首先采用乙腈-水作为流动相,结果发现新芒果苷、芒果苷峰形不佳,色谱峰出现分叉现象。考虑到该两种物质呈弱酸性,故采用乙腈-0.2%醋酸水溶液作为流动相以抑制其解离,结果显示其分叉现象消失,各峰之间的分离度良好,且基线平稳,因此最终采用乙腈-0.2%醋酸水溶液作为最终流动相系统。结果如图2所示。

      图  2  不同流动相系统对新芒果苷(1)和芒果苷(2)的影响

    • 流动相流出色谱柱后在载气压力的作用下与雾化气体(氮气)在雾化室内混合形成细小的液滴(气溶胶),气体流量越低,形成的液滴越大,散射光越多,分析灵敏度增加,反之越小。但是较低的气体流量会造成溶剂难以蒸发,因此本研究考察了氮气流速分别为1.5、2.0、2.5 L/min时各待测物质的响应值,结果显示,当氮气流速为2.0 L/min 时待测物质响应值最大,信号噪音比率最大,适合分析。

    • 漂移管温度的设置主要取决于流动相的构成、样品的挥发性以及流动相的流速。一般来讲,对于有机溶剂含量比例高、流速低的流动相,其要求的漂移管温度也低。本研究使用含新芒果苷386 μg/ml、芒果苷371 μg/ml、知母皂苷BⅡ 867.2 μg/ml、宝藿苷Ⅰ 84.8 μg/ml、知母皂苷AⅢ 160 μg/ml的混合对照品溶液,考察了漂移管温度分别为80、90、100 ℃时各待测物质的响应值,结果表明当漂移管温度为90 ℃时各物质峰面积响应值均较大,信号噪音比率最大,适合分析,因此最终漂移管温度采用90 ℃。结果如图3所示。

      图  3  漂移管温度对待测物质响应值的影响

      本研究建立了一种同时测定知母药材中包括芒果苷、知母皂苷BⅡ在内的5种活性成分含量的HPLC-ELSD方法。该法快速、简便、准确度高,可为知母的质量评价和质量标准的提升提供科学依据,为知母有效成分的体内动态变化研究提供测定方法。

参考文献 (7)

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