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用HPLC法同时测定养血安神糖浆中4种成分的含量

陆萍 倪东杰 郑巍 郭良君 王翔

陆萍, 倪东杰, 郑巍, 郭良君, 王翔. 用HPLC法同时测定养血安神糖浆中4种成分的含量[J]. 药学实践与服务, 2021, 39(3): 270-273. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202006072
引用本文: 陆萍, 倪东杰, 郑巍, 郭良君, 王翔. 用HPLC法同时测定养血安神糖浆中4种成分的含量[J]. 药学实践与服务, 2021, 39(3): 270-273. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202006072
LU Ping, NI Dongjie, ZHENG Wei, GUO Liangjun, WANG Xiang. One step assay of the four plant ingredients in Yangxue Anshen syrup by HPLC method[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2021, 39(3): 270-273. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202006072
Citation: LU Ping, NI Dongjie, ZHENG Wei, GUO Liangjun, WANG Xiang. One step assay of the four plant ingredients in Yangxue Anshen syrup by HPLC method[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2021, 39(3): 270-273. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202006072

用HPLC法同时测定养血安神糖浆中4种成分的含量

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202006072
详细信息
    作者简介:

    陆 萍,本科,主管药师,研究方向:质量标准研究,Tel:(0572)3269832,Email:luping86@126.com

    通讯作者: 王 翔,硕士,主管药师,研究方向:制剂开发,Tel:(0572)3269832,Email:wanggg0214@foxmail.com
  • 中图分类号: R284.1

One step assay of the four plant ingredients in Yangxue Anshen syrup by HPLC method

图(1) / 表(2)
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-06-18
  • 修回日期:  2020-10-21
  • 网络出版日期:  2021-05-25
  • 刊出日期:  2021-05-25

用HPLC法同时测定养血安神糖浆中4种成分的含量

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202006072
    作者简介:

    陆 萍,本科,主管药师,研究方向:质量标准研究,Tel:(0572)3269832,Email:luping86@126.com

    通讯作者: 王 翔,硕士,主管药师,研究方向:制剂开发,Tel:(0572)3269832,Email:wanggg0214@foxmail.com
  • 中图分类号: R284.1

摘要:   目的  建立同时测定养血安神糖浆中槲皮苷、木犀草苷、芦丁和2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量的方法。  方法  采用HPLC法。色谱柱为Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)。流动相:0.1%醋酸(A)-甲醇(B)梯度洗脱,0~15 min,95%~90%A;15~35 min,90%~70%A;35~55 min,70%~60%A;55~85 min,60%~50%A;85~95 min,10%A。流速:1.0 ml/min,检测波长:256 nm和320 nm,柱温30 ℃,进样量10 μl。  结果  槲皮苷、木犀草苷、芦丁和2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷分别在10~300、5.0~150.0、5.0~150.0、20.0~600.0 µg/ml范围呈良好的线性关系(r≥0.9989);加样回收率分别为(96.75±1.41)%、(99.61±1.01)%、(97.18±1.96)%和(99.12±0.97)%(n = 6)。  结论  该方法简单、准确、稳定,可同时测定养血安神糖浆中4种成分的含量。

English Abstract

陆萍, 倪东杰, 郑巍, 郭良君, 王翔. 用HPLC法同时测定养血安神糖浆中4种成分的含量[J]. 药学实践与服务, 2021, 39(3): 270-273. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202006072
引用本文: 陆萍, 倪东杰, 郑巍, 郭良君, 王翔. 用HPLC法同时测定养血安神糖浆中4种成分的含量[J]. 药学实践与服务, 2021, 39(3): 270-273. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202006072
LU Ping, NI Dongjie, ZHENG Wei, GUO Liangjun, WANG Xiang. One step assay of the four plant ingredients in Yangxue Anshen syrup by HPLC method[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2021, 39(3): 270-273. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202006072
Citation: LU Ping, NI Dongjie, ZHENG Wei, GUO Liangjun, WANG Xiang. One step assay of the four plant ingredients in Yangxue Anshen syrup by HPLC method[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2021, 39(3): 270-273. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202006072
  • 养血安神糖浆为陆军第七十二集团军医院(以下简称本院)自制制剂(批准文号:南制字(2016)B504019),由首乌藤、鸡血藤、熟地黄、合欢皮、墨旱莲、仙鹤草和生地制成,具有滋阴养血、宁心安神功效,临床用于精神倦怠、失眠健忘、肾虚腰酸、头晕乏力。首乌藤为方中君药,为蓼科植物何首乌的干燥根茎,具养血安神、祛风通络之功效,主含2,3,5,4’-四羟基-二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷[1]。处方中墨旱莲、仙鹤草、合欢皮中均含槲皮苷;墨旱莲、仙鹤草、熟地黄、生地中均含木犀草苷;墨旱莲、仙鹤草中均含芦丁[2-4]。槲皮苷、木犀草苷和芦丁均属于黄酮类化合物,具有免疫调节和抗氧化功能[5-6]。因此,将槲皮苷、木犀草苷和芦丁作为黄酮类成分的指标性成分进行整体质量控制。养血安神糖浆现行《卫生部颁药品标准中药成方制剂》[7]标准只有检查项,未收载含量测定方法,不利于质量控制。因此,笔者以安神作用突出的槲皮苷和葡萄糖苷,以及木犀草苷和芦丁为测定指标,建立同时测定4组分含量的HPLC法,填补了制剂无含量测定方法的空白,并为提高质量标准及工艺改进提供一定的研究基础。

    • Waters e2695高效液相色谱仪,Waters 2489双波紫外可见光检测器,Empower 3工作站[沃特世科技(上海)有限公司];756PC紫外可见光光度计(上海舜宇恒平科学仪器有限公司);KQ2200DE型数控超声波清洗器(上海精若科学仪器有限公司);Sartorius BS 124S型电子天平(德国赛多利斯);80-2台式低速离心机(上海医疗器械有限公司手术器械厂)。

    • 2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品(批号:110844-201109)、槲皮苷对照品(批号:111538-201606)、木犀草苷对照品(批号:111801-201003)和芦丁对照品(批号:100080-200707)均购自中国食品药品检定研究院,供含量测定用。养血安神糖浆(本院制剂室自制,规格:250 ml/瓶,批号:191008、191211、200309、200422、200519);100%甲醇为色谱纯(德国默克股份两合公司),分析纯95%乙醇,水为重蒸去离子水,其他试剂均为分析纯。

    • ①对照品储备液:精密称取槲皮苷、木犀草苷、芦丁对照品各10.0 mg,2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品20.0 mg,分别置10 ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,制成槲皮苷、木犀草苷、芦丁1 mg/ml的对照品储备液,2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷2 mg/ml的对照品储备液。②对照品稀释液:分别精密量取槲皮苷、木犀草苷、芦丁、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品储备液各2 ml,加甲醇稀释至10 ml,制成含槲皮苷、木犀草苷、芦丁对照品稀释液各0.2 mg/ml,2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品稀释液0.4 mg/ml。③混合对照溶液:分别精密量取4组分对照品稀释液各1 ml置5 ml容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,混匀,微孔滤膜(0.45 μm)过滤,取续滤液即得。

    • 精密量取养血安神糖浆10 ml,加甲醇稀释至50 ml,超声(100 W,40 kHz)15 min,离心10 min(转速:4 000 r/min,离心半径12 cm),取上清液微孔滤膜(0.45 μm)过滤,即得[8]

    • 色谱柱为Waters Symmetry C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。流动相:0.1%醋酸(A)-甲醇(B),按如下条件梯度洗脱:0~15 min,95%~90%A;15~35 min,90%~70%A;35~55 min,70%~60%A;55~85 min,60%~50%A;85~95 min,10%A。每一针结束后以初始比例平衡20 min;流速1.0 ml/min,检测波长:2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷和芦丁为320 nm,槲皮苷和木犀草苷均为256 nm;柱温30 ℃,进样量10 μl。在上述条件下,芦丁、槲皮苷、木犀草苷和2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷分离度均大于1.5;理论塔板数均不低于3 000,见图1

      图  1  养血安神糖浆供试品和对照品的HPLC图

    • 精密吸取槲皮苷对照品储备液0.2、0.6、1.5、3.0 ml,置10 ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,混匀,配制成20、60、150、300 μg/ml对照品溶液。再对上述20 μg/ml对照品溶液进行对半稀释,获得10 μg/ml对照品溶液。最终获得10~300 μg/ml浓度梯度的槲皮苷对照品溶液。分别精密吸取木犀草苷和芦丁对照品储备液0.1、0.5、1.5 ml,置10 ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,混匀,配制成10、50、150 μg/ml对照品溶液,再依次对上述对照品溶液进行对半稀释,获得5、25、75 μg/ml对照品溶液。最终分别获得5~150 μg/ml浓度梯度的木犀草苷和芦丁对照品溶液。精密吸取2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品储备液0.2、1.5、3.0 ml,置10 ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,混匀,配制成40、300、600 μg/ml对照品溶液。再对上述对照品溶液进行对半稀释,获得20、150、300 μg/ml对照品溶液。最终获得20~600 μg/ml浓度梯度的2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液。精密吸取上述溶液各10 μl,按“2.2”项下色谱条件进样测定,以峰面积值(Y)为纵坐标,对照品浓度(X,μg/ml)为横坐标,绘制标准曲线,经直线回归得线性方程,结果见表1。结果表明,4组分在一定浓度范围内呈良好线性关系,该法满足定量检测要求。

      表 1  4组分线性关系考察结果

      组分方程r浓度范围(μg/ml)
      槲皮苷Y=1.83×103X+162.820.999310~300
      木犀草苷Y=2.35×103X-189.430.99895~150
      芦丁Y=1.72×103X +53.710.99925~150
      2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷Y=4.55×103X +1902.310.999720~600
    • 精密量取混合对照品溶液2 ml,加甲醇稀释至10 ml,摇匀,按“2.2”项下色谱条件重复进样5次,记录峰面积。结果表明,4种组分峰面积RSD<3%(n=5),表明精密度良好。

    • 取同一批(批号:200309)样品6份,按“2.1.2”项下方法制备,按“2.2”项下方法测定4种组分含量,结果槲皮苷、木犀草苷、芦丁和2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量值分别为:106.34、43.66、24.68和427.12 μg/ml,4种组分含量RSD分别1.2%,1.5%,1.6%,1.7%(n=6),表明重现性较好。

    • 取同一供试品溶液(批号:200309),每隔4 h按“2.2”项下方法,分别于0、4、8、12、16、20、24 h测定4种组分的峰面积值。结果槲皮苷、木犀草苷、芦丁和2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的平均峰面积分别为196142、96161、37893、1923385,RSD分别为0.8%,0.9%,1.2%,1.0%(n=7),供试品溶液在24 h内稳定。

    • 精密量取已知含量的养血安神糖浆(批号:200309,槲皮苷、木犀草苷、芦丁和2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的平均含量为:106.34、43.66、24.68和427.12 μg/ml)1 ml,平行量取6份,分别精密加入“2.1.1”项下槲皮苷、木犀草苷、芦丁和2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品稀释液液各0.5、0.2、0.1、1.0 ml,按“-2.1.2”项下方法制备,进样前用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,按“2.2”项下方法测定,每组测6次,结果平均加样回收率分别为(96.75±1.41)%、(99.61±1.01)%、(97.18±1.96)%、(99.12±0.97)%,n = 6,表明方法准确度良好。

    • 按上述方法测定4批养血安神糖浆含量,每批平行测定3次,结果见表2

      表 2  养血安神糖浆含量测定结果(μg/ml,n=3,$ \bar x $±s)

      批号槲皮苷RSD(%)木犀草苷RSD(%)芦丁RSD(%)2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷RSD(%)
      19100896.901.7143.192.2923.192.73430.011.12
      94.6744.0722.98422.76
      97.8845.2124.18421.03
      191211107.132.8440.861.4423.522.77427.650.69
      102.3441.3422.26422.11
      101.7642.0523.57423.16
      200422104.162.2941.932.6624.532.06425.060.96
      99.8240.1823.84428.17
      100.5542.2223.57433.26
      200519101.331.3640.541.9220.192.54422.180.79
      98.6441.6221.91425.86
      99.7142.1020.85419.13
    • 本实验所测的4组分极性差异较大,选择流动相时,先后考察0.1%醋酸-甲醇、0.1%醋酸-乙腈、0.1%磷酸盐-甲醇和0.1%磷酸盐-乙腈溶液系统梯度洗脱,结果发现,以0.1%醋酸-甲醇作为流动相时,体系的基线平稳,峰型及分离度均显著优于其他体系,4组分色谱峰分离完全。

    • 根据槲皮苷、木犀草苷、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在双波长256 nm、320 nm下测得的色谱峰显示,分离度、色谱峰正态分布及峰面积都具有一致性,因此,根据色谱峰特征选择波长毫无争议。但是,在256 nm波长下,芦丁测得的峰面积是320 nm波长下峰面积的2倍,而320 nm波长下的峰分离度为3.4,256 nm波长下的峰分离度为1.8。从供试品图谱观察,在320 nm下峰形对称性较好。综上因素考量,本实验将芦丁的检测波长定为320 nm。

    • 同时考察了以50%甲醇、100%甲醇、50%乙醇、95%乙醇超声提取供试品,综合比较各组分的含量,最终选择100%甲醇超声提取的方法处理供试品。

      综上所述,本实验建立了以高效液相双波长法同时测定槲皮苷、木犀草苷、芦丁和2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷4组分含量的方法,操作简单,结果准确,可用于养血安神糖浆的质量控制,亦为下一步对养血安神糖浆的工艺改进研究打下了基础。

参考文献 (11)

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