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应中央军委要求,2022年9月起,《药学实践杂志》将更名为《药学实践与服务》,双月刊,正文96页;2023年1月起,拟出版月刊,正文64页,数据库收录情况与原《药学实践杂志》相同。欢迎作者踊跃投稿!

用反相高效液相色谱法同时测定复方酮康唑软膏中三组分的含量

吴博 王铁柱 拜年 刘冰 宋洪涛

吴博, 王铁柱, 拜年, 刘冰, 宋洪涛. 用反相高效液相色谱法同时测定复方酮康唑软膏中三组分的含量[J]. 药学实践与服务, 2021, 39(2): 152-156. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202006053
引用本文: 吴博, 王铁柱, 拜年, 刘冰, 宋洪涛. 用反相高效液相色谱法同时测定复方酮康唑软膏中三组分的含量[J]. 药学实践与服务, 2021, 39(2): 152-156. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202006053
WU Bo, WANG Tiezhu, BAI Nian, LIU Bing, SONG Hongtao. Determination of three constituents in compound ketoconazole ointment by RP-HPLC[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2021, 39(2): 152-156. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202006053
Citation: WU Bo, WANG Tiezhu, BAI Nian, LIU Bing, SONG Hongtao. Determination of three constituents in compound ketoconazole ointment by RP-HPLC[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2021, 39(2): 152-156. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202006053

用反相高效液相色谱法同时测定复方酮康唑软膏中三组分的含量

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202006053
详细信息
    作者简介:

    吴 博,硕士研究生,研究方向:药物新剂型和制剂新技术,Email:384336299@qq.com

    通讯作者: 宋洪涛,博士生导师,主任药师,研究方向:药物新剂型和制剂新技术,Email:sohoto@vip.163.com
  • 中图分类号: R917

Determination of three constituents in compound ketoconazole ointment by RP-HPLC

  • 摘要:   目的  建立同时测定复方酮康唑软膏中酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松含量的方法。  方法  采用反相高效液相色谱法,色谱柱为Intersil ODS-3(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇-pH5.5磷酸盐缓冲液(65∶35),柱温45 ℃,流速1.0 ml/min,检测波长248 nm。  结果  方法学验证表明,酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松3种成分线性关系良好(r≥0.9995),日内日间精密度均小于3.0%,回收率在90%~108%之间,稳定性和重复性的RSD均小于3.0%,符合方法学要求。按照新建立的方法测定了3个批次样品中三组分的含量,结果符合要求。  结论  该方法简便可靠,可为复方酮康唑软膏的质量控制提供依据,也为其质量标准研究奠定了基础。
  • 图  1  莫匹罗星、糠酸莫米松和酮康唑的紫外图谱

    A.莫匹罗星;B.糠酸莫米松;C.酮康唑

    图  2  复方酮康唑软膏的RP-HPLC色谱图

    A.莫匹罗星对照品溶液;B.糠酸莫米松对照品溶液;C.酮康唑对照品溶液;D.混合对照品溶液;E.供试品溶液;F.阴性溶液 1.莫匹罗星;2.糠酸莫米松;3.酮康唑

    表  1  复方酮康唑软膏中主药的线性方程

    药名线性方程r线性范围(µg/ml)
    莫匹罗星A=2.295C+10.200.999540.0~400.0
    糠酸莫米松A=28.240C+1.8710.99952.0~20.0
    酮康唑A=12.280C+27.940.999540.0~400.0
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    表  2  复方酮康唑软膏中三种主药的重复性试验结果

    药物含量(µg/ml)测得量(µg/ml)平均含量(µg/ml)RSD(%)
    莫匹罗星200.00203.60204.301.51
    200.00204.90
    200.00201.70
    200.00208.80
    200.00206.40
    200.00200.40
    糠酸莫米松10.0010.109.991.23
    10.009.91
    10.0010.06
    10.0010.10
    10.009.99
    10.009.79
    酮康唑200.00203.30203.600.65
    200.00203.90
    200.00202.60
    200.00204.90
    200.00205.00
    200.00201.60
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    表  3  复方酮康唑软膏中三种主药的稳定性试验结果

    主药时间(t/h)RSD
    (%)
    024681224
    莫匹罗星100.0099.94100.0099.9499.8199.1298.490.68
    糠酸莫米松100.0099.69100.49100.38100.3899.6598.370.74
    酮康唑100.0099.90100.06100.02100.0499.64100.000.15
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    表  4  复方酮康唑软膏中三种主药回收率试验结果(n=3)

    药名加入量(µg/ml)测得量(µg/ml)回收率(%)平均回收率(%)RSD
    (%)
    莫匹罗星160.00154.4096.5097.500.59
    160.00156.5997.87
    160.00155.8797.42
    200.00195.7697.88
    200.00193.3596.67
    200.00194.5597.28
    240.00235.7098.21
    240.00234.9297.88
    240.00234.7497.81
    糠酸莫米松8.007.7396.6297.990.79
    8.007.8498.00
    8.007.8397.91
    10.009.8898.80
    10.009.7197.10
    10.009.7897.80
    12.0011.8899.00
    12.0011.8598.75
    12.0011.7597.92
    酮康唑160.00153.6396.0297.620.74
    160.00156.3997.74
    160.00155.8497.40
    200.00195.7297.86
    200.00194.0697.03
    200.00195.4497.72
    240.00236.4698.52
    240.00235.6098.17
    240.00235.3898.08
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    表  5  3批次样品含量测定结果(n=3,%)

    样品批号酮康唑莫匹罗星糠酸莫米松
    2019041199.0399.20101.4
    20190415106.399.76101.6
    20190408100.6100.7100.7
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-06-20
  • 修回日期:  2021-03-13
  • 网络出版日期:  2021-03-31
  • 刊出日期:  2021-03-25

用反相高效液相色谱法同时测定复方酮康唑软膏中三组分的含量

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202006053
    作者简介:

    吴 博,硕士研究生,研究方向:药物新剂型和制剂新技术,Email:384336299@qq.com

    通讯作者: 宋洪涛,博士生导师,主任药师,研究方向:药物新剂型和制剂新技术,Email:sohoto@vip.163.com
  • 中图分类号: R917

摘要:   目的  建立同时测定复方酮康唑软膏中酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松含量的方法。  方法  采用反相高效液相色谱法,色谱柱为Intersil ODS-3(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇-pH5.5磷酸盐缓冲液(65∶35),柱温45 ℃,流速1.0 ml/min,检测波长248 nm。  结果  方法学验证表明,酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松3种成分线性关系良好(r≥0.9995),日内日间精密度均小于3.0%,回收率在90%~108%之间,稳定性和重复性的RSD均小于3.0%,符合方法学要求。按照新建立的方法测定了3个批次样品中三组分的含量,结果符合要求。  结论  该方法简便可靠,可为复方酮康唑软膏的质量控制提供依据,也为其质量标准研究奠定了基础。

English Abstract

吴博, 王铁柱, 拜年, 刘冰, 宋洪涛. 用反相高效液相色谱法同时测定复方酮康唑软膏中三组分的含量[J]. 药学实践与服务, 2021, 39(2): 152-156. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202006053
引用本文: 吴博, 王铁柱, 拜年, 刘冰, 宋洪涛. 用反相高效液相色谱法同时测定复方酮康唑软膏中三组分的含量[J]. 药学实践与服务, 2021, 39(2): 152-156. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202006053
WU Bo, WANG Tiezhu, BAI Nian, LIU Bing, SONG Hongtao. Determination of three constituents in compound ketoconazole ointment by RP-HPLC[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2021, 39(2): 152-156. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202006053
Citation: WU Bo, WANG Tiezhu, BAI Nian, LIU Bing, SONG Hongtao. Determination of three constituents in compound ketoconazole ointment by RP-HPLC[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2021, 39(2): 152-156. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202006053
  • 市售复方酮康唑乳膏包含酮康唑、硫酸新霉素和丙酸氯倍他索,是治疗浅部真菌感染的常用药物。其中,酮康唑是最常用的抗真菌药物,具有价格低、抗菌谱广、抗真菌活性强等优势。但细菌对硫酸新霉素易产生耐药性,可导致患者反复感染,难以根治,且丙酸氯倍他索不适合12岁以下儿童使用,副作用较多,可产生红斑、灼热、瘙痒等刺激症状,长期大面积用药可导致高血糖等[1-5]。针对上述问题,为改善市售产品的有效性和安全性,本课题组将硫酸新霉素替换为抗菌作用更强的莫匹罗星,将丙酸氯倍他索替换为副作用较少的糠酸莫米松,再结合酮康唑,制备新型复方酮康唑软膏,以提高患者的用药依从性[6-8]

    本研究采用反相高效液相色谱法同时测定复方酮康唑软膏中酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松3种药效成分的含量,该方法目前未见有文献报道。本法简便,灵敏,分离度好,准确性高,可以为该制剂的质量标准研究提供依据。

    • AL204型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);TU-1901型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司);Starter 2C型实验室pH计(奥豪斯仪器有限公司);KQ-800KDE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

    • 酮康唑对照品(批号:100294-201203,含量99.4%)、莫匹罗星对照品(批号:130568-200501,含量94.2%)、糠酸莫米松对照品(批号:100930-201201,含量99.9%)均购自中国食品药品检定研究院;酮康唑原料药(批号:20130405)、莫匹罗星原料药(批号:20130301)、糠酸莫米松原料药(批号:20130228)均购自武汉鑫佳公司;聚乙二醇400和聚乙二醇3350(中国医药对外贸易公司)。

    • 分别取酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松适量,精密称定,加流动相制备成适宜浓度的溶液,以相应的溶剂为空白溶液,在190~400 nm波长范围内进行紫外扫描,结果见图1

      图  1  莫匹罗星、糠酸莫米松和酮康唑的紫外图谱

      图1可见,莫匹罗星在220 nm处具有最大吸收波长,糠酸莫米松在248 nm处具有最大吸收波长,酮康唑在203 nm和245.5 nm具有最大吸收波长,三者在220 nm与248 nm之间均有吸收,因在供试品中酮康唑和莫匹罗星的浓度均是糠酸莫米松的20倍,糠酸莫米松在220 nm处响应值较小,为保证3种药物能同时测定,确定酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松的检测波长为248 nm。

    • 色谱柱:Intersil ODS-3柱(250 mm×4.6 mm,5 µm),流动相为甲醇-pH5.5磷酸盐缓冲液(65∶35),柱温45 ℃,流速1.0 ml/min,检测波长248 nm,进样量10 µl。理论塔板数以各组分峰计,均不低于5000,各色谱峰的分离度良好。

    • 酮康唑对照品溶液:取酮康唑20 mg,精密称定,置10 ml量瓶中,加入适量65%甲醇,超声使其完全溶解,加65%甲醇稀释至刻度,摇匀,得到酮康唑的标准储备液,4 ℃低温避光保存。精密吸取酮康唑的标准储备液1 ml,置于10 ml量瓶中,加65%甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。

      莫匹罗星对照品溶液:取莫匹罗星20 mg,精密称定,置10 ml量瓶中,加入适量65%甲醇,超声使其完全溶解,加65%甲醇稀释至刻度,摇匀,得到莫匹罗星的标准储备液,4 ℃低温避光保存。精密吸取莫匹罗星的标准储备液1 ml,置于10 ml量瓶中,加65%甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。

      糠酸莫米松对照品溶液:取糠酸莫米松10 mg,精密称定,置100 ml量瓶中,加入适量65%甲醇,超声使其完全溶解,加65%甲醇稀释至刻度,摇匀,得到糠酸莫米松的标准储备液,4 ℃低温避光保存。精密吸取糠酸莫米松的标准储备液1 ml,置于10 ml量瓶中,加65%甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。

      混合对照品溶液:取酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松的标准储备液各1 ml,置10 ml量瓶中,加65%甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。

    • 取复方酮康唑软膏0.5 g,精密称定,置于50 ml的容量瓶中,加65%甲醇适量,超声溶解,加65%甲醇稀释至刻度,摇匀,即得供试品溶液。

    • 取空白软膏基质0.5 g,精密称定,置于50 ml的容量瓶中,加65%甲醇适量,超声溶解,加65%甲醇稀释至刻度,摇匀,即得阴性对照溶液。

    • 取上述对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液,用0.22 μm微孔滤膜过滤,弃去初滤液,续滤液分别按照上述色谱条件进样,记录色谱图及相关参数。莫匹罗星的保留时间为5.075 min,理论塔板数为9196,对称因子0.81;糠酸莫米松的保留时间为18.413 min,理论塔板数为11859,对称因子0.88;酮康唑的保留时间为23.318 min,理论塔板数为12291,对称因子0.89,空白基质对莫匹罗星、糠酸莫米松和酮康唑的测定无干扰,方法专属性好。对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液色谱见图2

      图  2  复方酮康唑软膏的RP-HPLC色谱图

    • 分别精密吸取酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松标准储备液各0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2 ml,置10 ml量瓶中,用65%甲醇稀释至刻度,摇匀,0.22 μm微孔滤膜过滤,弃去初滤液,续滤液按上述色谱条件分别进样10 µl,记录色谱图峰面积。以峰面积A对浓度C (µg/ml)进行线性回归,结果见表1

      表 1  复方酮康唑软膏中主药的线性方程

      药名线性方程r线性范围(µg/ml)
      莫匹罗星A=2.295C+10.200.999540.0~400.0
      糠酸莫米松A=28.240C+1.8710.99952.0~20.0
      酮康唑A=12.280C+27.940.999540.0~400.0
    • 分别精密量取同一批复方酮康唑软膏6份,每份约0.5 g,按“2.3.2”项下操作,测定,计算酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松含量。结果见表2,结果表明该方法重复性良好。

      表 2  复方酮康唑软膏中三种主药的重复性试验结果

      药物含量(µg/ml)测得量(µg/ml)平均含量(µg/ml)RSD(%)
      莫匹罗星200.00203.60204.301.51
      200.00204.90
      200.00201.70
      200.00208.80
      200.00206.40
      200.00200.40
      糠酸莫米松10.0010.109.991.23
      10.009.91
      10.0010.06
      10.0010.10
      10.009.99
      10.009.79
      酮康唑200.00203.30203.600.65
      200.00203.90
      200.00202.60
      200.00204.90
      200.00205.00
      200.00201.60
    • 取供试品溶液,室温放置,分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样10 µl测定,计算不同时间点莫匹罗星、糠酸莫米松和酮康唑的含量,结果见表3

      表 3  复方酮康唑软膏中三种主药的稳定性试验结果

      主药时间(t/h)RSD
      (%)
      024681224
      莫匹罗星100.0099.94100.0099.9499.8199.1298.490.68
      糠酸莫米松100.0099.69100.49100.38100.3899.6598.370.74
      酮康唑100.0099.90100.06100.02100.0499.64100.000.15
    • 分别精密称取莫匹罗星8、10、12 mg,糠酸莫米松0.4、0.5、0.6 mg,酮康唑8、10、12 mg(相当于标示量的80%、100%、120%),精密称定,分别置于0.5 g的空白基质中,加适量流动相溶液,超声10 min使溶解,置于50 ml量瓶中,加流动相溶液稀释至刻度,摇匀,得低、中、高不同浓度的溶液,每个浓度各3份。用0.22 µm微孔滤膜过滤,弃去初滤液,续滤液按上述色谱条件分别进样,记录色谱图峰面积。根据回归方程计算出相应浓度和含量,并计算回收率、平均回收率及RSD。结果见表4

      表 4  复方酮康唑软膏中三种主药回收率试验结果(n=3)

      药名加入量(µg/ml)测得量(µg/ml)回收率(%)平均回收率(%)RSD
      (%)
      莫匹罗星160.00154.4096.5097.500.59
      160.00156.5997.87
      160.00155.8797.42
      200.00195.7697.88
      200.00193.3596.67
      200.00194.5597.28
      240.00235.7098.21
      240.00234.9297.88
      240.00234.7497.81
      糠酸莫米松8.007.7396.6297.990.79
      8.007.8498.00
      8.007.8397.91
      10.009.8898.80
      10.009.7197.10
      10.009.7897.80
      12.0011.8899.00
      12.0011.8598.75
      12.0011.7597.92
      酮康唑160.00153.6396.0297.620.74
      160.00156.3997.74
      160.00155.8497.40
      200.00195.7297.86
      200.00194.0697.03
      200.00195.4497.72
      240.00236.4698.52
      240.00235.6098.17
      240.00235.3898.08
    • 取3批样品,依法测定,结果见表5

      表 5  3批次样品含量测定结果(n=3,%)

      样品批号酮康唑莫匹罗星糠酸莫米松
      2019041199.0399.20101.4
      20190415106.399.76101.6
      20190408100.6100.7100.7
    • 本研究根据软膏剂的特性,选择了提取效率较高,操作简便的超声提取法进行样品前处理,对溶剂种类、溶剂体积、提取时间进行考察,最终选择65%甲醇50 ml,超声提取10 min,该提取方法可有效的除去样品中的杂质,让测定的专属性更高。

    • 对于流动相的选择,本实验尝试以甲醇-0.6%醋酸铵溶液作为流动相[9-12],结果基线非常不稳定,这可能是由于醋酸铵的紫外吸收所造成。以甲醇-水、乙腈-水,甲醇-磷酸二氢钠溶液和甲醇-乙腈-水等作为流动相[13-15],使用磷酸二氢钠溶液分离效果及峰形较好,有机相甲醇的比例应控制在一定范围,甲醇低于50%则酮康唑峰保留时间过长;流动相的酸度对酮康唑(弱碱性)和莫匹罗星(弱酸性)[16]的峰形及保留时间亦有影响,用磷酸将磷酸二氢钠的pH值调节到4.5、5.0、5.5和6.0。结果表明,当流动相的pH值为5.5时,莫匹罗星、糠酸莫米松和酮康唑的三组峰值均具有较好的分离度,并且无前延和拖尾现象。对于检测波长的选择,酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松在220 nm与248 nm均有吸收,因在供试品中酮康唑和莫匹罗星的浓度均是糠酸莫米松的20倍,为了让这三种药物能同时测定,提高检测的灵敏度,确定最佳检测波长为248 nm。对于色谱柱的选择,本研究考察了岛津、安捷伦和沃特世等品牌的色谱柱,最终选择了岛津Intersil ODS-3柱,三种待测成分在该柱上分离度好,峰形佳,所以确定为最佳色谱柱。

    • 3个批次的复方酮康唑软膏均为实验室自制,从测定结果可以看出,不同批次的样品中酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松的含量有一定波动,这提示我们在进行中试放大生产时,要充分考虑各因素的影响,保证制剂中主要成分的含量稳定,同时对软膏剂的长期稳定性也需要进行考察。

参考文献 (16)

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