留言板

尊敬的读者、作者、审稿人, 关于本刊的投稿、审稿、编辑和出版的任何问题, 您可以本页添加留言。我们将尽快给您答复。谢谢您的支持!

姓名
邮箱
手机号码
标题
留言内容
验证码

应中央军委要求,2022年9月起,《药学实践杂志》将更名为《药学实践与服务》,双月刊,正文96页;2023年1月起,拟出版月刊,正文64页,数据库收录情况与原《药学实践杂志》相同。欢迎作者踊跃投稿!

UPLC-MS/MS法测定人血浆中丙硫氧嘧啶的含量

李群英 凌琳 李盛建 周瑾 李甜甜 赵亮 吕磊

李群英, 凌琳, 李盛建, 周瑾, 李甜甜, 赵亮, 吕磊. UPLC-MS/MS法测定人血浆中丙硫氧嘧啶的含量[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(4): 350-353, 378. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202001063
引用本文: 李群英, 凌琳, 李盛建, 周瑾, 李甜甜, 赵亮, 吕磊. UPLC-MS/MS法测定人血浆中丙硫氧嘧啶的含量[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(4): 350-353, 378. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202001063
LI Qunying, LING Lin, LI Chengjian, ZHOU Jin, LI TianTian, ZHAO Liang, LÜ Lei. Determination of propylthiouracil in human plasma by UPLC-MS/MS[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(4): 350-353, 378. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202001063
Citation: LI Qunying, LING Lin, LI Chengjian, ZHOU Jin, LI TianTian, ZHAO Liang, LÜ Lei. Determination of propylthiouracil in human plasma by UPLC-MS/MS[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(4): 350-353, 378. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202001063

UPLC-MS/MS法测定人血浆中丙硫氧嘧啶的含量

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202001063
详细信息
    作者简介:

    李群英,本科,主管药师,研究方向:临床药学,Email: ldyyyjk2015@sina.com

    通讯作者: 吕 磊,硕士,主管药师,研究方向:中药药效物质基础及体内代谢,Email: k_owen2002@126.com
  • 中图分类号: R917

Determination of propylthiouracil in human plasma by UPLC-MS/MS

图(1) / 表(4)
计量
  • 文章访问数:  3354
  • HTML全文浏览量:  1036
  • PDF下载量:  29
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2020-01-15
  • 修回日期:  2020-05-08
  • 网络出版日期:  2020-07-27
  • 刊出日期:  2020-07-25

UPLC-MS/MS法测定人血浆中丙硫氧嘧啶的含量

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202001063
    作者简介:

    李群英,本科,主管药师,研究方向:临床药学,Email: ldyyyjk2015@sina.com

    通讯作者: 吕 磊,硕士,主管药师,研究方向:中药药效物质基础及体内代谢,Email: k_owen2002@126.com
  • 中图分类号: R917

摘要:   目的  建立UPLC-MS/MS法测定人血浆中丙硫氧嘧啶的含量,为临床治疗药物监测(TDM)和生物等效性试验(BE)提供方法学基础。  方法  采用Agilent SB-C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液(80∶20,V/V),等度洗脱。质谱采用AJS-ESI源,多反应监测(MRM)正离子模式,检测离子对为:丙硫氧嘧啶m/z 171.1→112.1、内标(丙硫氧嘧啶-D5)m/z 176.1→117.0。  结果  血浆中丙硫氧嘧啶在10~5 000 ng/ml范围内线性关系良好,r=0.999 3;批内和批间的精密度和准确度良好(RSD<10%,RE<±10%);不同浓度的基质效应均<110%,变异系数<5%;不同浓度的平均回收率为101.60%~113.56%,符合方法学要求。  结论  该方法快速简便、灵敏准确,适用于血浆中丙硫氧嘧啶的含量测定。

English Abstract

李群英, 凌琳, 李盛建, 周瑾, 李甜甜, 赵亮, 吕磊. UPLC-MS/MS法测定人血浆中丙硫氧嘧啶的含量[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(4): 350-353, 378. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202001063
引用本文: 李群英, 凌琳, 李盛建, 周瑾, 李甜甜, 赵亮, 吕磊. UPLC-MS/MS法测定人血浆中丙硫氧嘧啶的含量[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(4): 350-353, 378. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202001063
LI Qunying, LING Lin, LI Chengjian, ZHOU Jin, LI TianTian, ZHAO Liang, LÜ Lei. Determination of propylthiouracil in human plasma by UPLC-MS/MS[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(4): 350-353, 378. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202001063
Citation: LI Qunying, LING Lin, LI Chengjian, ZHOU Jin, LI TianTian, ZHAO Liang, LÜ Lei. Determination of propylthiouracil in human plasma by UPLC-MS/MS[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(4): 350-353, 378. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202001063
  • 丙硫氧嘧啶(propylthiouracil),为硫脲类化合物,它可通过抑制甲状腺内过氧化物酶系统,阻止酪氨酸的碘化及碘化酪氨酸的缩合,从而抑制甲状腺激素的合成,是临床常用的治疗甲亢的药物[1-3]。其口服吸收迅速,约1~1.5 h达血药浓度峰值;代谢快,24 h内约有35%的药物以原型和葡萄糖醛酸化物的形式从尿中排出,血浆半衰期约为1~3 h[4]。口服丙硫氧嘧啶个体差异较大,由于其血浆蛋白结合率高(约为80%),且存在肝毒性,因此对其进行血药浓度监测,能使药物应用更为安全合理[5-6]。进口丙硫氧嘧啶的价格昂贵,研发高质量、低价格的国产仿制药具有良好的经济效益和社会效益[7],开发高效稳定的丙硫氧嘧啶的血药浓度测定方法,可为仿制药一致性评价中的生物等效性试验(BE)提供依据。

    目前,丙硫氧嘧啶的体内测定方法主要为高效液相色谱法(HPLC)[8-10],早期开发的液相测定方法,分析时间长,专属性和灵敏度均无法满足临床高通量测定的需求,因此,建立简单快速、灵敏准确的丙硫氧嘧啶血药浓度质谱分析方法(MS)具有重要意义。本文建立UPLC-MS/MS法测定人血浆中丙硫氧嘧啶的含量,可为临床治疗药物监测(TDM)和生物等效性试验(BE)提供方法学基础。

    • Agilent 1290 UPLC超高效液相色谱(安捷伦科技有限公司,美国),配有在线脱气机、二元泵、低温自动进样器和柱温箱;Agilent 6470 Triple Quad三重四极杆质谱(安捷伦科技有限公司,美国),配有AJS-ESI喷射流电喷雾离子源、MassHunter分析工作站;SECURA125-1CN型十万分之一电子天平、Arium mini超纯水仪(赛多利斯,德国);Fresco 21低温离心机(赛默飞,美国)。

    • 对照品丙硫氧嘧啶(批号:100803-201503,纯度>99.4%)购自中国食品药品检定研究院,内标丙硫氧嘧啶-D5(批号:13-EQJ-150-1,纯度>98%),购自Toronto Research Chemicals;甲酸为色谱纯(ACS恩科化学,美国);甲醇和乙腈为色谱纯(霍尼韦尔,美国);水为超纯水。

    • 色谱柱为Agilent SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相采用甲醇-0.1%甲酸水溶液(80∶20,V/V),等度洗脱;流速:1 ml/min,柱后分流比2∶3;柱温30 ℃;进样量5 μl,分析时间3min。

    • 采用AJS-ESI源,正离子模式,离子源参数:干燥气温度350 ℃;干燥气流速10 L/min;雾化器压力40 psi;鞘气温度350 ℃;鞘气流速11 L/min;毛细管电压4 000 V。多反应监测(MRM)的参数:丙硫氧嘧啶m/z 171.1→112.1,碎片电压110 V,碰撞能量30 eV;丙硫氧嘧啶-D5(IS)m/z 176.1→117.0,碎片电压110 V,碰撞能量30 eV。丙硫氧嘧啶和氘代内标的保留时间均为1.9 min。

    • 精密称取丙硫氧嘧啶对照品1.5mg,置于2 ml称量瓶中,用移液器(已校准)加入甲醇适量溶解,涡旋混匀,配成1.0 mg/ml的对照品储备液;取上述对照品储备液适量,用甲醇逐级稀释,配成浓度分别为200、500、1000、2 000、10 000、20 000、40 000、80 000、100 000 ng/ml的系列对照品溶液,置4 ℃冰箱保存,备用。

    • 精密称取丙硫氧嘧啶-D5对照品1.3mg,置于2 ml称量瓶中,用移液器(已校准)加入甲醇适量溶解,涡旋混匀,配成1.0 mg/ml的内标储备液;取上述储备液适量,用乙腈(含5%甲酸)稀释400倍,得2 500 ng/ml的内标溶液,置于4 ℃冰箱保存,备用。

    • 取空白血浆950 μl,精密加入“2.2.1”项下制备的丙硫氧嘧啶系列标准溶液50 μl,旋涡混匀,配成浓度分别为10、25、50、100、500、1 000、2 000、4 000、5 000 ng/ml的标准含药血浆。同法制备4个浓度的质控样品(QC),分别为10、25、500、4 000 ng/ml,待用。

    • 血浆样品先置于室温下解冻,取100 μl血浆,依次加入200 μl内标溶液,200 μl乙腈(含5%甲酸),涡旋1min,于4 ℃下13000×g高速离心10 min,取100 μl上清液于进样瓶中,进行UPLC-MS/MS分析。

    • 通过比较6个不同健康志愿者的空白血浆样品、质控样品和给药后实际样品的色谱图来评估。分别取空白血浆、质控样品(QC-L)和受试者给药后的血样各100 μl,按“2.3”项下血浆样品前处理方法操作,进样,获得样品的色谱图(图1),包括空白样品色谱图、质控样品色谱图和实际样品色谱图。结果显示,空白血浆中的内源性成分不干扰待测物和内标出峰,选择性良好。

      图  1  血浆中丙硫氧嘧啶和内标的典型色谱图

    • 取“2.2.3”项下制备的标准含药血浆样品100 μl,按“2.3”项下血浆样品前处理方法操作,进样分析,记录色谱图。以待测物血浆浓度为横坐标(X),待测物与内标峰面积比为纵坐标(Y),进行回归,使用1/X 加权,求得回归方程: Y=0.000 4X−0.000 2(r=0.999 3)。结果表明,血浆中的丙硫氧嘧啶在10~5 000 ng/ml范围内线性关系良好。以S/N>10确定,定量下限(LLOQ)10 ng/ml,为标准曲线最低点。

    • 在LLQQ(10 ng/ml)、QC-L(25 ng/ml)、QC-M(500 ng/ml)、QC-H(4 000 ng/ml)4个浓度下,通过批内和批间分别考察。按“2.2.3”项下制备丙硫氧嘧啶4个浓度质控样品,每个浓度平行5份,按“2.3”项下血浆样品前处理操作,进样分析。并于每天制备4个浓度质控样本各5份,进样分析,连续3 d,计算批内、批间的精密度(RSD)及准确度(RE),批内和批间的RSD<10%, RE<±10%,结果见表1

      表 1  丙硫氧嘧啶精密度和准确度试验结果

      浓度(ng/ml)批内(n=5)批间(n=15)
      精密度(RSD/%)准确度 (RE/%)精密度(RSD/%)准确度(RE/%)
      103.40−0.558.38−0.88
      258.35−5.599.53 1.63
      5007.61−1.006.21−3.39
      4 0002.90−2.794.71−5.95
    • 取6位健康志愿者的空白血浆,在相当于QC-L(25 ng/ml)和QC-H(4000 ng/ml)的2个浓度下来考察。先按“2.3”项下血浆样品前处理方法制备空白基质上清,然后加入丙硫氧嘧啶及内标的标准溶液,以使其终浓度与处理后QC-L和QC-H一致;同时制备相同浓度不含基质的待测物和内标的乙腈溶液,进样分析。通过峰面积分别计算待测物和内标的基质因子,进一步得到经内标归一化的基质因子。不同基质下,2个浓度基质效应的变异系数均小于5%,符合方法学要求,结果见表2

      表 2  丙硫氧嘧啶的基质效应试验结果(n=6)

      浓度(ng/ml)待测物
      基质因子(%)
      内标
      基质因子(%)
      归一化
      基质因子(%)
      变异系数(%)
      2525.9423.99108.181.78
      4 00021.9121.92100.620.66
    • 取单一来源的空白血浆,在相当于QC-L(25 ng/ml)、QC-M(500 ng/ml)、QC-H(4 000 ng/ml)的3个浓度下来考察。先按“2.3”项下血浆样品前处理方法制备空白基质上清,然后加入丙硫氧嘧啶及内标的标准溶液,以使其终浓度与处理后QC-L、QC-M、QC-H一致;同时按“2.2.3”和“2.3”项下制备和处理3个浓度的QC样品,每个浓度平行操作5份,分别进样分析。通过峰面积计算待测物的提取回收率,平均回收率为101.60%~113.56%,结果见表3

      表 3  丙硫氧嘧啶的提取回收率试验结果(n=5)

      被分析物浓度(ng/ml)回收率(%)RSD(%)
      丙硫氧嘧啶 25101.605.30
      500113.561.72
      4 000108.826.26
    • 首先通过新鲜配制丙硫氧嘧啶和内标的储备液1.0 mg/ml,考察对照品储备液于4 ℃下放置30 d的稳定性,结果显示,RE<±10%,稳定性良好。然后在QC-L(25 ng/ml)、QC-H(4 000 ng/ml)2个浓度下,分别考察4种条件下丙硫氧嘧啶的稳定性:室温放置4 h、自动进样器(4 ℃)放置24 h,冻融循环3次,以及−80 ℃下冻存30 d,每个浓度平行操作5份。按“2.3”项下血浆样品前处理操作,进样分析,将丙硫氧嘧啶和内标峰面积的比值代入随行标准曲线求得实测浓度,计算RE以及RSD,结果(见表4)显示稳定性良好。

      表 4  考察不同条件下丙硫氧嘧啶的稳定性试验结果(n=5)

      浓度(ng/ml)室温放置4h4 ℃放置24h冻融循环3次−80 ℃冻存30 d
      RE(%)RSD(%)RE(%)RSD(%)RE(%)RSD(%)RE(%)RSD(%)
      25 2.826.58 1.996.004.674.858.175.59
      4 000−4.656.24−7.704.514.823.903.731.93
    • 通过在定量上限(ULOQ)5 000 ng/ml完成测定之后立即测定空白样品来评估。结果显示,分析物保留时间处峰面积小于LLOQ的20%,IS保留时间处的峰面积小于实际IS的5%。该方法几乎无残留,不影响测定。

    • 通过使用空白基质将定量上限(ULOQ)10倍(50 000 ng/ml)和50倍(250 000 ng/ml)浓度的样品稀释至定量范围(10~5 000 ng/ml)来评估,每个浓度平行操作5次。结果表明,RSD和RE均低于15%,样品稀释不影响测定的精密度和准确度。

    • 常用的样品前处理方法为蛋白沉淀和液液萃取,优先采用简单的蛋白沉淀法。沉淀剂考察了甲醇和乙腈,结果发现乙腈沉淀更完全,在同位素内标下,归一化的基质效应更低,添加5%甲酸后,待测物峰形更好,因此选择乙腈(含5%甲酸)为沉淀剂。进一步考察了血浆与沉淀剂的比例(1∶3、1∶4、1∶5,V/V),结果发现,比例为1∶4时,提取回收率最高,最终选定为前处理方法。

    • 首先考察了甲醇-水和乙腈-水体系,结果发现,虽然乙腈-水体系的洗脱能力更强,但甲醇-水体系下峰形更佳,血浆中内源性成分与主峰分离完全,基线噪音小。在水相中添加0.1%的甲酸,可以显著提高丙硫氧嘧啶的质谱响应,检测灵敏度令人满意,也可进一步改善峰拖尾。柱后采用了2∶3分流,实际进入质谱的流速约为0.4 ml/min,既保障了色谱柱的最佳流速(1 ml/min),又保证了ESI源的离子化效率,结果稳定可靠。

    • 丙硫氧嘧啶在正离子模式下的响应明显优于负离子模式,因此确定采用正离子模式检测。采用Optimizer质谱参数优化程序依次对雾化室参数(鞘气温度、鞘气流速、干燥气温度、干燥气流速、雾化器压力、毛细管电压)以及MRM参数(母离子、子离子、碎片电压、碰撞能)进行调节优化,最终依据丙硫氧嘧啶和内标的检测灵敏度,确定了“2.2.2”项下最佳的质谱参数。得益于采用的同位素内标,丙硫氧嘧啶和氘代内标出峰稳定,虽保留时间同为1.9 min,但并没有离子串扰影响,而且归一化的基质效应结果满意。

      综上,本文建立了快速简便、灵敏准确的测定人血浆中丙硫氧嘧啶含量的UPLC-MS/MS方法。样品采用简单蛋白沉淀法处理,LLOQ为10 ng/ml,基质效应低,回收率高,每个样本的分析时间3 min,每天可分析超过400样本,满足高通量测定需要。本研究为丙硫氧嘧啶的治疗药物监测(TDM)和生物等效性试验(BE)提供了方法学基础。

参考文献 (10)

目录

    /

    返回文章
    返回