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应中央军委要求,2022年9月起,《药学实践杂志》将更名为《药学实践与服务》,双月刊,正文96页;2023年1月起,拟出版月刊,正文64页,数据库收录情况与原《药学实践杂志》相同。欢迎作者踊跃投稿!

肾衰宁颗粒指纹图谱研究及3种有效成分含量测定

宋新华 陈旭娇 邓冯沂 高守红 彭辉

宋新华, 陈旭娇, 邓冯沂, 高守红, 彭辉. 肾衰宁颗粒指纹图谱研究及3种有效成分含量测定[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(3): 259-263. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.201911005
引用本文: 宋新华, 陈旭娇, 邓冯沂, 高守红, 彭辉. 肾衰宁颗粒指纹图谱研究及3种有效成分含量测定[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(3): 259-263. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.201911005
SONG Xinhua, CHEN Xujiao, DENG Fengyi, GAO Shouhong, PENG Hui. Research on the fingerprint and three active components assay in Shenshuaining granules by HPLC[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(3): 259-263. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.201911005
Citation: SONG Xinhua, CHEN Xujiao, DENG Fengyi, GAO Shouhong, PENG Hui. Research on the fingerprint and three active components assay in Shenshuaining granules by HPLC[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(3): 259-263. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.201911005

肾衰宁颗粒指纹图谱研究及3种有效成分含量测定

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.201911005
基金项目: 上海市临床药学重点专科建设项目(2016-40044-002);上海市卫生计生系统重要薄弱学科建设项目(2016ZB0303)
详细信息
    作者简介:

    宋新华,硕士研究生,Email:songxinhua0317@163.com

    通讯作者: 高守红,硕士,副主任药师,研究方向:药物分析与临床药学,Tel:(021)51322403,Email:gaoshouhong@126.com彭辉,教授,研究方向:内分泌及代谢疾病,Email:phycjx818@163.com
  • 中图分类号: R284.1

Research on the fingerprint and three active components assay in Shenshuaining granules by HPLC

  • 摘要:   目的  通过高效液相色谱法建立肾衰宁颗粒的指纹图谱,并测定肾衰宁颗粒中3种有效成分(橙皮苷、丹酚酸B和大黄酚)的含量,为肾衰宁颗粒的质量控制提供依据。  方法  采用SunFireTM C18色谱柱,乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相,梯度洗脱,流速1 ml/min,检测波长254 nm,柱温25 ℃,建立肾衰宁颗粒的指纹图谱,并对3种有效成分的含量进行测定。  结果  测定10批肾衰宁颗粒的色谱图,确立的标准指纹图谱上有22个共有峰,各批次的指纹图谱与对照图谱之间相似度均不小于0.90,相似度良好。方法学验证结果表明重复性、稳定性、精密度结果均符合要求。  结论  本法操作简单、可靠,适用于肾衰宁颗粒指纹图谱的建立及含量测定,为肾衰宁颗粒的质量控制提供依据。
  • 图  1  10批肾衰宁颗粒的色谱图

    图  2  混合对照品溶液(A)和供试品溶液(B)色谱图

    1.橙皮苷;2.丹酚酸B;3.大黄酚

    表  1  梯度洗脱条件

    时间(t/min)乙腈(%)0.1%甲酸溶液(%)
    0595
    12377
    182575
    193070
    317525
    608515
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    表  2  10批肾衰宁颗粒HPLC指纹图谱相似度

    样品号S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10对照指纹图谱
    S11.0000.9800.9100.9410.9340.9480.9160.9410.9500.8740.965
    S20.9801.0000.9340.9340.9320.9450.9510.9460.9780.8670.973
    S30.9100.9341.0000.9520.9470.9370.9720.9400.9450.9140.973
    S40.9410.9340.9521.0000.9900.9840.9510.9710.9230.9400.986
    S50.9340.9320.9470.9901.0000.9780.9380.9760.9100.9100.979
    S60.9480.9450.9370.9840.9781.0000.9540.9870.9310.9230.986
    S70.9160.9510.9720.9510.9380.9541.0000.9490.9660.9130.979
    S80.9410.9460.9400.9710.9760.9870.9491.0000.9280.8900.980
    S90.9500.9780.9450.9230.9100.9310.9660.9281.0000.8920.969
    S100.8740.8670.9140.9400.9100.9230.9130.8900.8921.0000.937
    对照指纹图谱0.9650.9730.9730.9860.9790.9860.9790.9800.9690.9371.000
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    表  3  各成分线性关系

    对照品回归方程r线性范围(μg/ml)
    橙皮苷Y=2.391 8X–2.798 30.999 740~400
    丹酚酸BY=10.689X–5.578 30.999 810~100
    大黄酚Y=58.983X+121.990.999 97~350
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    表  4  加样回收率试验结果

    成分取样量(V/ml)样品含量(m/μg)加入量(m/μg)测得量(m/μg)回收率(%)平均回收率(%)
    橙皮苷1.00383.0295.88773.46101.80100.27
    1.00380.3995.88764.91100.26
    1.00380.3195.88763.64 99.95
    1.00384.4695.88771.17100.83
    1.00385.8195.88772.95100.94
    1.00389.2095.88764.32 97.81
    丹酚酸B1.00120.7931.80250.42101.91 98.82
    1.00122.5031.80251.14101.12
    1.00125.5631.80248.78 96.87
    1.00127.5731.80254.87100.07
    1.00127.7431.80251.44 97.25
    1.00127.7531.80249.44 95.66
    大黄酚1.00 72.6717.79138.19 92.06 97.36
    1.00 69.6217.79135.41 92.44
    1.00 68.4617.79140.83101.69
    1.00 71.0317.79141.25 98.66
    1.00 68.9817.79141.57102.00
    1.00 71.9217.79141.17 97.30
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    表  5  10批肾衰宁样品中3种成分的测定结果

    药品批号橙皮苷(μg/ml)丹酚酸B(μg/ml)大黄酚(μg/ml)
    6110310266.9942.2944.65
    5110311083.4139.3442.89
    5110311194.7541.3644.51
    51103009 34680.5743.2143.44
    51103011 59383.5142.0442.58
    51103018 48679.9441.9442.96
    51103010 47190.0341.8844.03
    41103033 56383.4843.0143.94
    6110310185,9242.9343.85
    5110310588.0441.7642.94
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-11-02
  • 修回日期:  2020-03-18
  • 网络出版日期:  2020-05-20
  • 刊出日期:  2020-05-01

肾衰宁颗粒指纹图谱研究及3种有效成分含量测定

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.201911005
    基金项目:  上海市临床药学重点专科建设项目(2016-40044-002);上海市卫生计生系统重要薄弱学科建设项目(2016ZB0303)
    作者简介:

    宋新华,硕士研究生,Email:songxinhua0317@163.com

    通讯作者: 高守红,硕士,副主任药师,研究方向:药物分析与临床药学,Tel:(021)51322403,Email:gaoshouhong@126.com彭辉,教授,研究方向:内分泌及代谢疾病,Email:phycjx818@163.com
  • 中图分类号: R284.1

摘要:   目的  通过高效液相色谱法建立肾衰宁颗粒的指纹图谱,并测定肾衰宁颗粒中3种有效成分(橙皮苷、丹酚酸B和大黄酚)的含量,为肾衰宁颗粒的质量控制提供依据。  方法  采用SunFireTM C18色谱柱,乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相,梯度洗脱,流速1 ml/min,检测波长254 nm,柱温25 ℃,建立肾衰宁颗粒的指纹图谱,并对3种有效成分的含量进行测定。  结果  测定10批肾衰宁颗粒的色谱图,确立的标准指纹图谱上有22个共有峰,各批次的指纹图谱与对照图谱之间相似度均不小于0.90,相似度良好。方法学验证结果表明重复性、稳定性、精密度结果均符合要求。  结论  本法操作简单、可靠,适用于肾衰宁颗粒指纹图谱的建立及含量测定,为肾衰宁颗粒的质量控制提供依据。

English Abstract

宋新华, 陈旭娇, 邓冯沂, 高守红, 彭辉. 肾衰宁颗粒指纹图谱研究及3种有效成分含量测定[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(3): 259-263. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.201911005
引用本文: 宋新华, 陈旭娇, 邓冯沂, 高守红, 彭辉. 肾衰宁颗粒指纹图谱研究及3种有效成分含量测定[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(3): 259-263. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.201911005
SONG Xinhua, CHEN Xujiao, DENG Fengyi, GAO Shouhong, PENG Hui. Research on the fingerprint and three active components assay in Shenshuaining granules by HPLC[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(3): 259-263. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.201911005
Citation: SONG Xinhua, CHEN Xujiao, DENG Fengyi, GAO Shouhong, PENG Hui. Research on the fingerprint and three active components assay in Shenshuaining granules by HPLC[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(3): 259-263. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.201911005
  • 肾衰宁颗粒由太子参、黄连、制半夏、陈皮、茯苓、大黄、丹参、牛膝、红花、甘草等十味中药制成;具有补气健脾,活血化痰,祛浊的功效[1]。有文献表明,肾衰宁在治疗慢性肾脏疾病中疗效较为显著[2];在尿毒症腹膜透析患者的治疗过程中能够降低血清硫酸吲哚酯浓度[3];对于慢性肾脏病的Ⅳ期患者,在西医基础治疗的同时服用肾衰宁颗粒,可以明显改善肾功能,同时提升患者的治愈率,具有较高的临床使用价值[4]。由于中药成分复杂[5],使得如何控制中药的质量成为十分重要的问题。指纹图谱是在了解中药物质整体作用的基础上,通过光谱和色谱技术获得中药化学成分的光谱或色谱图,以鉴别中药的真伪,评价质量的一致性和产品的稳定性,其具有信息量大、特征性强、完整性和模糊性等特点[6]。指纹图谱中的质量控制技术既能保证中药的功效,又在实现中药现代化过程中起关键性作用[7]。因此,本实验以10个批次的肾衰宁颗粒为研究对象,拟建立肾衰宁颗粒的指纹图谱,对肾衰宁颗粒进行质量评价。

    肾衰宁颗粒是由十味中药组成的复方制剂,其化学成分十分复杂,且许多复方治疗疾病的药物基础并不明显,因此检测成分必须是发挥药效的有效成分[8],本实验针对大黄中的大黄酚(chrysophanol)[9-10]、丹参中的丹酚酸B(salvianolic acid B)[11]、陈皮中的橙皮苷(hesperidin)[9, 12]3种指标性成分,进行HPLC法含量测定。在多成分的质量控制检测成本高而对照品紧缺的情况下,能较大程度地节约检验成本,又可较全面地控制该制剂的质量,保证临床用药的有效性和安全性,同时为肾衰宁颗粒的质量控制提供参考。

    • Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司),包含G1311C四元泵,G1329B自动进样器,G1316A柱温箱,G4212B-DAD二极管阵列检测器,Chemstation色谱工作站;光电分析天平(德国Sartorius公司,CPA 225D型),最大载荷220 g,分度值0.01 mg;冷冻真空浓缩仪(丹麦Labogene公司,ScanVac ScanSpeed 40型);超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司,SK7200H型);涡旋混匀器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司,Vortex QL-901型)。

    • 肾衰宁颗粒(德元堂制药集团,批号:51103111、51103009 346、51103010 471、51103011 593、51103105、51103018 486、41103033 563、51103110、61103102、61103101)。蜕皮激素(ecdysterone,批号:P11N6F5706)、甘草苷(liquiritin,批号:2O1027BA14)、甘草酸(glycyrrhizic acid,批号:230A6B1)、大黄酚(chrysophanol,批号:T31O6F5345)、丹酚酸B(salvianolic acid B,批号:Y14M7H14804)、橙皮苷(hesperidin,批号:K02M3C1)对照品,均由上海源叶有限公司提供。大黄素(modin,批号:110756-200110)、盐酸小檗碱(berberine hydrochloride,批号:09030522)对照品,由中国食品药品检定研究院提供。甲醇、乙腈、甲酸,均为德国Merck公司生产,色谱纯。二氯甲烷,色谱纯。水为纯净水,娃哈哈公司生产。

    • 色谱柱:Waters SunFire™ C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)。流动相A:乙腈;流动相B:0.1%甲酸溶液,梯度洗脱。流速:1 ml/min。柱温:25 ℃。进样量:10 μl。检测波长:254 nm。梯度洗脱条件见表1

      表 1  梯度洗脱条件

      时间(t/min)乙腈(%)0.1%甲酸溶液(%)
      0595
      12377
      182575
      193070
      317525
      608515
    • 精密依次称取丹酚酸B、橙皮苷、大黄素标准品10.25、10.35、10.05 mg,分别置于10 ml容量瓶中,以纯甲醇定容至刻度,摇匀,得储备液并将其分装后储存于−20 ℃的冰箱中。精密称取10.10 mg大黄酚,置于10 ml容量瓶中,加入少量二氯甲烷溶解,超声处理3 min,然后用纯甲醇稀释至刻度,摇匀,得到对照品的储备液,置于−20 ℃冰箱保存。

    • 取肾衰宁颗粒适量,研磨成细粉,混合均匀,精密称取0.10 g,加适量70%甲醇溶液使其溶解,超声45 min,再用70%甲醇溶液定容至2 ml,冷却,过0.45 μm微孔滤膜后,取续滤液进样分析。

    • 取肾衰宁颗粒(批号:41103033 563),按照“2.3”项制备供试品溶液,在“2.1”项色谱条件下连续进样5次,通过大黄素(7号色谱峰)作为参照峰,确定相对保留时间和相对峰面积。相对保留时间的RSD在1.0%以内,相对峰面积的RSD在2.0%以内,表明进样仪器的精密度良好。

    • 取肾衰宁颗粒(批号:41103033 563),按照“2.3”项平行制备5份供试品溶液,测定在“2.1”项色谱条件下的相对保留时间和相对峰面积。相对保留时间RSD在1.0%以内,相对保留面积RSD在2.0%以内。表明该实验方法的重复性良好。

    • 取肾衰宁颗粒(批号:41103033 563),并根据“2.3”项下平行制备5份供试品溶液,在“2.1”项色谱条件下,分别记录0、4、8、24、36 h的相对保留时间和相对峰面积。相对保留时间RSD在1.0%以内,相对保留面积RSD在2.0%以内。表明供试样品溶液在36 h内稳定性好。

    • 分别称取10个批次的肾衰宁粉末,按照“2.3”项制备供试品溶液,每个批次平行制备3份供试品溶液,记录图谱,见图1。利用中国药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2008A版”的软件,将10批次肾衰宁颗粒的图谱导入,将批号为61103102的样品溶液用作针对相似性计算校正的参考图。结果显示,1~9批制剂间指纹图谱与对照图谱之间相似度均不小于0.90,见表2,表明相似度良好。对保留时间0~60 min内的色谱峰进行分析,均有22个稳定的特征峰,确定其为肾衰宁的共有指纹峰,经过标准品比对,其中,6号峰为橙皮苷,14号峰为丹酚酸B,21号峰为大黄酚。

      图  1  10批肾衰宁颗粒的色谱图

      表 2  10批肾衰宁颗粒HPLC指纹图谱相似度

      样品号S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10对照指纹图谱
      S11.0000.9800.9100.9410.9340.9480.9160.9410.9500.8740.965
      S20.9801.0000.9340.9340.9320.9450.9510.9460.9780.8670.973
      S30.9100.9341.0000.9520.9470.9370.9720.9400.9450.9140.973
      S40.9410.9340.9521.0000.9900.9840.9510.9710.9230.9400.986
      S50.9340.9320.9470.9901.0000.9780.9380.9760.9100.9100.979
      S60.9480.9450.9370.9840.9781.0000.9540.9870.9310.9230.986
      S70.9160.9510.9720.9510.9380.9541.0000.9490.9660.9130.979
      S80.9410.9460.9400.9710.9760.9870.9491.0000.9280.8900.980
      S90.9500.9780.9450.9230.9100.9310.9660.9281.0000.8920.969
      S100.8740.8670.9140.9400.9100.9230.9130.8900.8921.0000.937
      对照指纹图谱0.9650.9730.9730.9860.9790.9860.9790.9800.9690.9371.000
    • 按照“2.2”项下制备标准品溶液,得到混合对照品色谱图见图2。将标准品储备液用纯甲醇稀释,丹酚酸B浓度梯度为:10、20、40、80和100 μg/ml;橙皮苷浓度梯度为:40、80、160、320和400 μg/ml;大黄酚浓度梯度为:8、16、40、100和350 μg/ml。在“2.1”项色谱条件下,分别记录3种成分的峰面积,以峰面积(Y)对浓度(X)进行线性回归,结果见表3

      图  2  混合对照品溶液(A)和供试品溶液(B)色谱图

      表 3  各成分线性关系

      对照品回归方程r线性范围(μg/ml)
      橙皮苷Y=2.391 8X–2.798 30.999 740~400
      丹酚酸BY=10.689X–5.578 30.999 810~100
      大黄酚Y=58.983X+121.990.999 97~350
    • 取同一对照品溶液,根据“2.1”项下色谱条件进行测定,重复进样5次,并记录峰面积。橙皮苷、丹酚酸B、大黄酚峰面积的RSD分别为0.17%、0.20%、0.15%,表明仪器精密度良好。

    • 精密吸取橙皮苷、丹酚酸B、大黄酚对照品溶液适量,使用甲醇逐步稀释,至色谱图中上述3种成分的峰高分别为噪音的3倍和10倍,测得橙皮苷的检测限和定量限分别为0.18和1 μg/ml;丹酚酸B的检测限和定量限分别为0.3和1.2 μg/ml;大黄酚的检测限和定量限分别为1和5 μg/ml。

    • 取同一供试品溶液(批号:41103033 563),并根据“2.1”项色谱条件在0、2、4、8、24、36 h测定。橙皮苷、丹酚酸B、大黄酚的峰面积的RSD分别为2.01%、2.22%、2.05%,结果表明:供试品在36 h内稳定。

    • 取同一供试品溶液(批号:41103033 563),平行制备6份,并根据“2.1”项色谱条件进行测定,橙皮苷、丹酚酸B、大黄酚的峰面积的RSD分别为0.67%、2.00%、2.02%,表明系统重复性良好。

    • 精密量取肾衰宁溶液1 ml,分别加入100%含量橙皮苷对照品(理论值为192.02 μg),100%含量丹酚酸B对照品(理论值为62.66 μg),100%含量大黄酚对照品(理论值35.22 μg),按照“2.2”项平行制备6份,并根据“2.1”的色谱条件进行测量,按照下述公式计算加样回收率,平均加样回收分别为119.20%、84.69%、84.58%。结果见表4

      表 4  加样回收率试验结果

      成分取样量(V/ml)样品含量(m/μg)加入量(m/μg)测得量(m/μg)回收率(%)平均回收率(%)
      橙皮苷1.00383.0295.88773.46101.80100.27
      1.00380.3995.88764.91100.26
      1.00380.3195.88763.64 99.95
      1.00384.4695.88771.17100.83
      1.00385.8195.88772.95100.94
      1.00389.2095.88764.32 97.81
      丹酚酸B1.00120.7931.80250.42101.91 98.82
      1.00122.5031.80251.14101.12
      1.00125.5631.80248.78 96.87
      1.00127.5731.80254.87100.07
      1.00127.7431.80251.44 97.25
      1.00127.7531.80249.44 95.66
      大黄酚1.00 72.6717.79138.19 92.06 97.36
      1.00 69.6217.79135.41 92.44
      1.00 68.4617.79140.83101.69
      1.00 71.0317.79141.25 98.66
      1.00 68.9817.79141.57102.00
      1.00 71.9217.79141.17 97.30

      回收率=(实测量-样品含量)/加入量×100%。

    • 取10批肾衰宁颗粒,按“2.2”项制备试液,按“2.1”项色谱条件测定,结果见表5

      表 5  10批肾衰宁样品中3种成分的测定结果

      药品批号橙皮苷(μg/ml)丹酚酸B(μg/ml)大黄酚(μg/ml)
      6110310266.9942.2944.65
      5110311083.4139.3442.89
      5110311194.7541.3644.51
      51103009 34680.5743.2143.44
      51103011 59383.5142.0442.58
      51103018 48679.9441.9442.96
      51103010 47190.0341.8844.03
      41103033 56383.4843.0143.94
      6110310185,9242.9343.85
      5110310588.0441.7642.94
    • 在190~400 nm处全波长扫描,盐酸小檗碱、大黄素、大黄酚、丹酚酸B、蜕皮激素、甘草酸、甘草苷、橙皮苷分别在345、254、254、286、250、237、237、283 nm处有最大吸收,通过对比分析,在波长254 nm处,上述8种成分具有良好的响应,样品中相邻色谱峰的基线分离可以满足含量检测的要求。因此,选择波长254 nm作为检测波长。

    • 将肾衰宁粉末直接用水溶解后进样,发现样品出峰很少,所测成分在色谱条件下没有吸收。后用50%、70%、80%的甲醇溶解样品,发现用70%甲醇溶解出峰数最多,且所测成分在此条件下均有吸收,故选择70%甲醇进行样品的前处理。

    • 有文献报道,肾衰宁含量测定使用甲醇-0.1%磷酸[13]、乙腈-水-1%甲酸[14]、乙腈-05%磷酸[15]进行90 min的大梯度洗脱,发现色谱峰分不开,且特征峰较少。经过反复实验,确定乙腈-0.1%甲酸水溶液用作梯度洗脱的流动相,分离出样品中测得的特征峰,特征峰很多,峰形良好。

参考文献 (15)

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