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RRx-001是一种源于航空工业的肿瘤免疫治疗药物[1]，其化学结构中含有溴代乙酰和双硝基氮杂环丁基团，目前处于III期临床试验[2]。RRx-001作为单一药物、放疗增敏剂或免疫增敏剂[3]，用于细胞肺癌[4]、转移性结直肠癌[5]、卵巢癌[6]和胶质母细胞瘤[7]等肿瘤的治疗，显示出良好的疗效和安全性。研究发现，RRx-001具有多种作用机制，如靶向CD47-SIRPα信号通路，使肿瘤相关巨噬细胞复极化，由抗炎症M2表型转为促炎症M1表型[8]；使肿瘤血管正常化，增加化疗药物渗透，产生代谢产物RONS，导致肿瘤细胞坏死[9]；通过表观遗传抑制活性激活抑癌基因[10]等。作为靶向CD47的小分子药物，RRx-001在临床试验中未发现CD47抗体药物常见的嗜血综合征，表现出优于抗体大分子药物的安全性[11]。但RRx-001也存在明显的输注部位反应，因而临床需要采用特殊的注射器材，通过血液共同输注方式给药。
RRx-001结构中的溴代乙酰基为共价结合片段，也是其产生活性的药效基团[1]。为进一步探讨RRx-001的构效关系，本文拟采用骨架跃迁的药物设计策略，以不同的共价结合片段代替溴代乙酰基，分析其对抗肿瘤活性的影响，从而为后续基于RRx-001骨架的药物设计研究提供借鉴（图1）。
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实验所用试剂分别采购自泰坦、毕得、乐研等公司，各类试剂均为市售分析纯或化学纯。核磁共振仪采用的是德国Bruke的600、400和300 MHz型，采用TMS作为内标，DMSO-d6、CDCl3或D2O等为溶剂。耦合常数（J）和化学位移（δ）单位分别用Hz和ppm来表示。高分辨质谱为德国Bruke micrOTOF
10257 ，抗肿瘤活性测试所用仪器为Biotek Synergy H2多功能酶标仪。薄层色谱（TLC）使用的硅胶板为GF254（中国青岛海洋化学），柱层析使用的是200~300目硅胶（中国青岛海洋化学）。 -
将多聚甲醛（24.1 g，0.8 mol）加入250 ml三颈烧瓶中，然后加入0.16 %氢氧化钠水溶液（40 ml），升温至40 ℃。缓慢滴加硝基甲烷（10.6 ml，0.2 mol），滴加结束后升温至60 ℃，滴加叔丁胺（21.2 ml，0.2 mol），滴加结束后继续反应10 min。反应液冷却至室温后过滤，水洗，干燥得38.8 g白色固体1，收率89.4 %，mp：136.1~138.2 ℃。1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ：5.35（t, J=5.8 Hz, 1 H），4.42（t, J=10.0 Hz, 2 H），3.81（d, J=7.9 Hz, 1 H），3.63–3.51（m, 4 H），2.59（d, J=12.3 Hz, 1 H），0.95（s, 9 H）。
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两颈烧瓶中依次加入500 ml无水乙醇、12 ml浓盐酸和化合物1（20.0 g，0.09 mol），加热回流反应6 h。反应结束后，减压蒸去溶剂，加入异丙醇搅拌0.5 h，过滤，洗涤，干燥得17.0 g白色晶体2，收率78.2 %，mp：175.5~178.3 ℃。1H NMR（400 MHz, D2O）δ：4.12（d, J=12.5 Hz, 2 H）, 3.88（d, J=12.5 Hz, 2 H）, 3.76（s, 2H）, 1.36（s, 9 H）。
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在氮气保护下，将化合物2（5.0 g，0.02 mol）加入到250 ml三颈烧瓶中，分别加入50 ml无水四氢呋喃和偶氮二甲酸二异丙酯（5.6 g，0.03 mol），升温至60 ℃。然后，将溶有三苯基磷（7.4 g，0.03 mol）的四氢呋喃溶液（15 ml）滴加到反应液中，滴加结束后继续反应5 h。反应液冷却至室温后过滤，洗涤，干燥得3.9 g白色固体3，收率86.6 %，mp：165.3~174.0 ℃。1H NMR（400 MHz, D2O）δ：4.74（s, 2 H）, 4.43（s, 2 H）, 4.16（s, 2 H）, 1.26（s, 9 H）。
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将化合物3（7.0 g，0.03 mol）和氢氧化钠水溶液（4.3 g，90 ml H2O）加入到250 ml两颈烧瓶中，室温搅拌2 h，冰浴冷却到10 ℃以下后，滴加亚硝酸钠（8.6 g，0.12 mol）、K3Fe（CN）6（1.0 g，0.003 mol）和水（5 ml）配成的溶液。控制反应温度为10~15 ℃下，分批次加入过硫酸钠（10.3 g，0.04 mol），然后升温至室温，反应过夜。反应液用20 ml二氯甲烷萃取3次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸去溶剂得5.5 g黄色液体4，收率88.1 %。1H NMR（400 MHz, CDCl3）δ：4.12（s, 4 H）, 1.05（s, 9 H）。
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25 ml两颈烧瓶中依次加入化合物4（5.0 g，0.03 mol）、醋酸酐（9.8 ml，0.11 mol）和三氟硼酸乙醚溶液（0.5 ml，3.88 mmol），加热至120 ℃，回流反应12 h。减压蒸去溶剂，柱层析纯化（二氯甲烷 : 甲醇=100 : 1）得2.8 g淡黄色固体5，收率60.0 %，mp：110.1~113.9 ℃。1H NMR（600 MHz, CDCl3）δ：4.98（s, 2 H）, 4.82（s, 2 H）, 2.02（s, 3 H）。
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将化合物5（1.0 g，5.29 mmol）加入到50 ml单颈烧瓶，然后加入6.3 ml 的5 %盐酸溶液，回流反应4 h。反应液冷却至室温，过滤，滤液减压蒸去溶剂得0.6 g黄色固体6，收率58.2 %，mp：150.3~155. 2 ℃。1H NMR（600 MHz, DMSO-d6）δ：4.98（s, 4 H）, 3.42（s, 2 H）。
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将化合物6（0.6 g，3.16 mmol）和15 ml水加入到50 ml两颈烧瓶中，升温至40 ℃，再滴加5 %碳酸氢钠溶液至pH为8。反应液用10 ml二氯甲烷萃取3次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸去溶剂得0.4 g黄色油状液体7，收率84.7 %。1H NMR（600 MHz, CDCl3）δ：4.51（s, 4 H）, 2.20（s, 1 H）。
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将关键中间体3, 3-二硝基氮杂环丁烷7（74.0 mg，0.50 mmol）加入到25 ml单颈烧瓶后，分别加入干燥的二氯甲烷（4 ml）和碳酸氢钠（42.0 mg，0.50 mmol），冰浴冷却至0 ℃后，滴加各种酰氯或磺酰氯（0.55 mmol），完全反应后减压蒸去溶剂，柱层析纯化（二氯甲烷 : 甲醇=100 : 1）得化合物ZM528~ZM531。
ZM528，白色固体，83 mg，收率61.3%。1H NMR（300 MHz, CDCl3） δ: 6.46（dd, J=16.9, 1.2 Hz, 1 H）, 6.16（dd, J=16.9, 10.4 Hz, 1 H）, 5.88（dd, J=10.4, 1.2 Hz, 1 H）, 4.96（s, 4 H）. HRMS（ESI, positive）m/z calcd for C5H7N3O5 [M + H]+:
202.0464 ; found 202.0458。ZM529，白色固体，77 mg，收率60.2%。1H NMR（300 MHz, DMSO-d6）δ: 7.47（s, 2 H）, 4.77（s, 4 H）. HRMS（ESI, positive）m/z calcd for C3H6N4O6S [M + H]+:
226.0008 ; found 226.0013。ZM530，白色固体，54 mg，收率50.1%。1H NMR（600 MHz, CDCl3）δ: 5.63–5.61（m, 1 H）, 5.45（s, 1 H）, 4.93（s, 4 H）, 1.97（dd, J=1.6, 1.1 Hz, 3 H）。HRMS（ESI, positive）m/z calcd for C7H9N3O5 [M + H]+:
216.0620 ; found 216.0615。ZM531，淡黄色固体，81 mg，收率69.6%。1H NMR（600 MHz, CDCl3）δ: 6.58（dd, J=16.5, 9.8 Hz, 1 H）, 6.46（d, J=16.6 Hz, 1 H）, 6.27（d, J=9.8 Hz, 1 H）, 4.75（s, 4 H）。
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选用人结肠癌细胞HCT-116和人非小细胞肺癌细胞A549，于海军军医大学药物化学教研室冻存和传代。96孔板边缘每孔加入100 μl的PBS溶液防止边缘效应，内部每孔加入浓度为7×104个/ml的细胞悬液100 μl，置于37 ℃、5%二氧化碳培养箱内。24 h后，弃去96孔板内培养液，每孔分别加入100 μl受试化合物样品液和对照品液，设三复孔。将96孔板置于37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养72 h。实验采用CCK-8法[14-16]。在基础培养基中加入10 % CCK-8试剂制成混合液，弃去96孔板内旧培养基，加入混合液，100 μl/孔，将96孔板置于37 ℃、5 %二氧化碳培养箱中孵育2~4 h。使用酶标仪于450 nm波长处测定荧光OD值。细胞生长抑制率IC%=（空白对照孔OD值-给药孔OD值）/空白对照孔OD值×100%。根据各个浓度的IC%值，用GraphPad软件进行线性回归，算出各受试化合物抑制细胞生长50%的药物浓度，即IC50。
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参考文献[12-13]设计了关键中间体3, 3-二硝基氮杂环丁烷的合成路线，合成路线见图2。以多聚甲醛和硝基甲烷为起始原料，通过环合、开环、Mistunobu、反向Henrry、脱叔丁基/乙酰化、脱乙酰基、碱化等7步反应合成出关键中间体7，总收率为14.9 %。其中，反向Henrry反应对催化剂的用量和反应温度较为敏感，经过反应条件优化，反应温度为10~15 ℃时，亚硝酸钠和K3Fe（CN）6的用量分别为化合物3的4倍和10%时，该步反应收率达88.1%，相比原有路线提升了6.3%。
将关键中间体7与各种酰氯或磺酰氯在三乙胺和碳酸氢钠催化下发生酰胺化反应，以较高收率合成得到目标化合物ZM528~ZM531（图3）。
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采用CCK-8法测定目标化合物对肿瘤细胞株HCT-116和A549的体外抗肿瘤活性，以多柔比星（DOX）和RRx-001为阳性对照药，结果见表1。从表中可以看出，4个化合物均能保持一定的抗肿瘤活性，但相比RRx-001，均出现明显下降，其中丙烯酰基类化合物ZM528活性最高，对HCT-116和A549的IC50分别为（6.0±2.7）和（5.1±4.8）μmol/L。当丙烯酰基的2位引入甲基后活性明显下降，以磺酰基代替酰基后，活性也呈现下降趋势。以磺酰胺基代替丙烯酰基后，对HCT-116和A549肿瘤细胞株的活性分别下降了6.4和5.4倍，但当以磺酰基代替磺酰胺基后活性基本保持。以上研究结果初步表明，RRx-001的溴代乙酰基对抗肿瘤活性影响较大，以其他共价结合片段代替后活性出现明显下降。
化合物IC50（μmol/L） HCT-116细胞株 A549细胞株 RRx-001 0.94±0.7 <0.2 ZM528 6.0±2.7 5.1±4.8 ZM529 38.1±19.7 27.3±10.4 ZM530 >50 14.4±3.0 ZM531 34.5±13.5 36.3±5.3 DOX <0.2 <0.2 -
采用骨架跃迁药物设计策略，设计合成出4个RRx-001衍生物。体外抗肿瘤活性研究发现，所有新化合物对HCT-116和A549细胞株的抑制活性均显示出明显的下降，但能保持一定的抗肿瘤活性，其中丙烯酰基类化合物ZM528活性最高，对两种肿瘤细胞株的IC50分别为（6.0±2.7）和（5.1±4.8） μmol/L，其原因可能是RRx-001的共价结合片段为溴乙酰基，结合活性高于其他共价结合片段。初步构效关系显示，氮杂环丁烷的氨基上溴代乙酰基取代后活性最高，丙烯酰基取代活性次之。研究结果和初步构效关系为以RRx-001为骨架的新型靶向CD47药物的进一步优化设计研究提供了理论指导。
Synthesis and Antitumor Activity of Novel RRx-001 Derivatives
doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202408053
- Received Date: 2024-08-30
- Rev Recd Date: 2025-03-06
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Key words:
- RRx-001 /
- immuno-oncology /
- covalent inhibitor /
- synthesis /
- antitumor
Abstract:
| Citation: | WU Ruonan, TANG Wenmin, GAO Lin, WU Yuelin, LUO Chuan, MIAO Zhenyuan. Synthesis and Antitumor Activity of Novel RRx-001 Derivatives[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202408053
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