Identification of chemical constituents of Xiakucao Xiaoliu mixture by HPLC-TOF/MS

DAI Yuanyuan; WANG Xiaohe; MA Minghua; JI Qiangguo; GU Xiaoyan; WU Tiejun; NIAN Hua

doi:10.3969/j.issn.1006-0111.201907116

Volume 38 Issue 2

Apr. 2020

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DAI Yuanyuan, WANG Xiaohe, MA Minghua, JI Qiangguo, GU Xiaoyan, WU Tiejun, NIAN Hua. Identification of chemical constituents of Xiakucao Xiaoliu mixture by HPLC-TOF/MS[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(2): 138-142, 155. doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.201907116

Citation:

DAI Yuanyuan, WANG Xiaohe, MA Minghua, JI Qiangguo, GU Xiaoyan, WU Tiejun, NIAN Hua. Identification of chemical constituents of Xiakucao Xiaoliu mixture by HPLC-TOF/MS[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(2): 138-142, 155. doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.201907116

Identification of chemical constituents of Xiakucao Xiaoliu mixture by HPLC-TOF/MS

doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.201907116

1.
Pharmaceutial Center of Yueyang Hospital, Shanghai University of TCM, Shanghai 200437, China
2.
Pharmaceutical Center of Yangpu District Central Hospital, Shanghai 200090, China

Received Date: 2019-07-25
Rev Recd Date: 2019-11-12

Available Online: 2020-04-23

Publish Date: 2020-03-01

Abstract

Objective To identify the chemical constituents of Xiakucao Xiaoliu mixture by high performance liquid chromatography-high resolution time-of-flight mass spectrometry (HPLC-TOF/MS). Methods The chromatographic separation ACE (3.0mm×150 mm) column was used. The mobile phase was methanol (A) and 0.1% formic acid (B). The gradient elution was: 0-5 min, 5% A; 5-10 min, 5%-15% A; 10-30 min, 15%-45%A; 30-40 min, 45%-70%B; 40-50 min, 70%-90%B. The injection volume was 2 μl. The flow rate was 0.4 ml/min. The column temperature was 25°C. The mass spectrometry was characterized by time-of-flight mass spectrometry, using ESI ion source. The common monitoring was in positive and negative ion mode. The reference ion was m/z 121.9856, 1033.9881. The scanning range was m/z 100-1200. Results A total of 37 chemical constituents were identified in the Xiakucao Xiaoliu mixture, 8 in the positive ion mode fragment voltage of 160 V, 28 in the negative ion mode fragment voltage of 160 V, and 19 in the fragment voltage of 260 V. Both positive and negative ions had 4 responses. The negative ion mode has 16 responses under both fragment voltages. And the ingredients were medicinal. Conclusion An effective method for the identification of the chemical constituents of Prunella vulgaris L. by HPLC-TOF/MS was established, which laid a foundation for its quality control and in-depth study in vivo.
- Xiakucao Xiaoliu mixture,
- chemical composition,
- identification,
- high performance liquid-high resolution time-of-flight mass spectrometry

References

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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com

1.
沈阳化工大学材料科学与工程学院沈阳 110142

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夏枯草消瘤合剂由中药夏枯草、牡蛎、生地黄、莪术、苍术、白术组成，是中医肿瘤学专家钱伯文教授的经验方。方中诸药配伍，以达化痰软坚，活血化瘀，补养气血的功效。其临床实验研究已证实，该药配合一线化疗方案治疗中晚期非小细胞肺癌患者，有助于提高患者的生存治疗和减少化疗所产生的毒副作用^[1]。由该方制成的合剂在我院临床使用多年，前期研究对于组方中化学成分的研究仍限于迷迭香酸、咖啡酸的稳定性研究^[2]。尽管方中一些单味药的化学成分已有报道^[3-18]，但是整个复方制剂的化学成分未见报道。由于组分的复杂性，复方的成分分析比单味药更具有挑战性，明确夏枯草消瘤方色谱图中各个色谱峰归属对于该复方的质量控制及体内深入研究具有重要意义。

高效液相-高分辨飞行时间质谱（HPLC-TOF/MS）串联技术对于中药复杂体系中化学成分分析和鉴定非常有效。其灵敏度高、操作简便、耗时短，可以在短时间获得化合物准确的相对分子质量，通过与所建立的已知化学成分数据库比对，可以快速的对被测成分进行分析鉴别^[19-20]。因此，本文采用HPLC-TOF/MS技术，首次对夏枯草消瘤方中化学成分进行鉴别，并且对各成分进行药材归属，以进一步阐明夏枯草消瘤方的化学物质基础。

1. 材料和方法

1.1. 仪器

Agilent 1100系列高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），配有在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱和二级管阵列检测器；Agilent 6220高分辨飞行时间质谱仪（美国安捷伦公司），配有标准电子喷雾离子源（ESI）；分析软件为 MassHunter 数据采集在线工作站和Qualiative Analysis 离线分析软件。

1.2. 药品与试剂

咖啡酸（批号：110885-200102，纯度>98.5%）、迷迭香酸（批号：111871-201505，纯度>98.5%）对照品，均购自中国食品药品检定研究院，甲醇和甲酸为色谱纯（Fisher，USA），其余试剂均为分析纯，水为纯水。

夏枯草、生地黄、莪术、麸炒苍术、麸炒莪术、牡蛎、煅牡蛎均由上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院中药房提供（见表1）。药材及饮片均经第二军医大学药学院生药学教研室黄宝康教授鉴定。

药材名称	批号	药材来源
夏枯草	180207	上海康桥药业有限公司
生地黄	180302	上海同济堂药业有限公司
莪术	180306	上海虹桥中药饮片有限公司
麸炒白术	2018031001	上海上药华宇药业有限公司
麸炒苍术	180407	上海虹桥中药饮片有限公司
牡蛎	2017102006	上海上药华宇药业有限公司
煅牡蛎	180301	上海同济堂药业有限公司

2. 方法

2.1. 对照品溶液的制备

分别精密称取咖啡酸、迷迭香酸对照品3.22、5.68 mg置10 ml量瓶中，加甲醇稀释定容，配成浓度分别为322、568 μg/ml的母液，精密吸取母液 1 ml 置于 10 ml 量瓶，加甲醇定容后，即得对照品溶液。

2.2. 供试品溶液的制备

精密称取夏枯草4.2 g、牡蛎8.4 g、煅牡蛎8.4 g、地黄4.2 g、莪术4.2 g、白术（麸炒）2.1 g、苍术（麸炒）2.1 g，以上七味，充分润湿，分别加8倍量与4倍量水煎煮两次，每次煮沸后于85 ℃保温20 min，煎液滤过，合并滤液，滤液浓缩至相对密度1.10以上（80 ℃），离心，取上清液；精密吸取夏枯草消瘤方溶液上清液5 ml，置于50 ml容量瓶中，加甲醇定溶，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得夏枯草消瘤方样品溶液。

2.3. 色谱条件

色谱柱：ACE C₁₈（3.0 mm×150 mm），流动相A相为甲醇，B相为水（含0.1%甲酸），梯度洗脱：0~5 min：5%A，5~10 min：5%~15%A，10~30 min：15%~45%A，30~40 min：45%~70%B，40~50 min：70%~90%B；进样量2 μl，流速为0.4 ml/min；柱温为25 ℃；运行时间为50 min。

2.4. 质谱条件

采用ESI离子源，正、负离子模式均进行检测，雾化器为高纯氮气，具体参数如下：正离子模式：毛细管电压3500 V，干燥器温度350 ℃，干燥器流速10L/min，雾化器压力40 psig，碎片电压160 V；参比离子m/z121.9856，1033.9881；扫描范围m/z100-1200。测定样品之前，使用调谐液校准质量轴，以保证质量精度误差小于1×10^-6。

2.5. 夏枯草消瘤方化学成分数据库的建立

根据国内外专业数据库中科院化学专业数据库、Pubmed、Chemspider等，以及国内外相关研究文献，收集了夏枯草消瘤合剂方中六味中药化学成分名称及分子式共760个。采用安捷伦“formula-database generator”软件（含各元素精确质量数），根据各成分碳、氢、氧的个数，计算精确相对分子质量、M+H和M-H准分子离子峰相对分子质量的相应的化学成分数据库。

4. 结论

本研究运用 HPLC-TOF/MS 技术快速鉴别夏枯草消瘤合剂中37种化学成分，其中正离子模式碎片电压160 V条件下8个；负离子模式碎片电压160 V条件下28个，碎片电压260 V条件下19个；正负离子均有响应4个，负离子模式两种碎片电压下均有响应16个，并对成分进行了药材归属。该方法在传统的植物化学分离提取基础上对色谱峰进一步明确化，为夏枯草消瘤方的质量控制、体内的深入研究及临床应用奠定了良好的基础。

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序号	相对时间（min）	化合物	分子式	M+H	实验值（m/z）	理论值（m/z）	误差（×10^–6）	来源
1	19.174	7-羟基异喹啉	C₉H₇NO	[M+H]⁺	146.060 8	146.052 8	–0.72	地黄.
2	24.032	Verrucarol	C₁₅H₂₂O₄	[M+H]⁺	267.159 1	267.151 8	0.06	莪术
3	28.388	白术内酯Ⅱ	C₁₅H₂₀O₂	[M+H]⁺	233.153 3	233.146 3	1.49	白术.
4¹⁾	30.653	芦丁	C₂₇H₃₀O₁₆	[M+H]⁺	611.160 8	611.153 4	–0.27	夏枯草
5¹⁾	30.703	槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷	C₂₁H₂₀O₁₂	[M+H]⁺	465.102 9	465.095 5	–0.25	夏枯草
6¹⁾	33.713	伞形酮	C₉ H₆ O₃	[M+H]⁺	163.038 7	163.031 7	1.54	夏枯草
7	38.337	白术内酯Ⅲ	C₁₅H₂₀O₃	[M+H]⁺	249.148 2	249.141 2	2.05	白术
8¹⁾	41.969	十四烷基柠檬酸	C₂₀H₃₆O₇	[M+H]⁺	389.252 9	389.246 1	1.31	白术
注：1)表示正负模式下测得

序号	相对时间（min）	化合物	分子式	M+H	实验值（m/z）	理论值（m/z）	误差（×10^–6）	来源
9¹⁾	1.999	精氨酸	C₆H₁₄N₄O₂	(M-H)^–	173.104 3	173.111 7	0.56	地黄
10¹⁾	2.109	葡萄糖酸	C₆H₁₂O₇	(M-H)^–	195.051 1	195.058 3	–0.23	夏枯草
11	2.789	苹果酸	C₄H₆O₅	(M-H)^–	133.014 3	133.021 5	–0.61	夏枯草
12	2.842	柠檬酸	C₇H₁₂O₆	(M-H)^–	191.019 5	191.027 0	1.04	夏枯草
13	3.305	二氢梓醇	C₁₅H₂₄O₁₀	(M+CHO₂)^–	409.134 8	409.136 9	0.88	地黄
14¹⁾	4.441	梓醇	C₁₅H₂₂O₁₀	(M+CHO₂)^–	407.118 8	407.121 2	2.01	地黄
15	4.724	尿嘧啶核苷	C₉H₁₂N₂O₆	(M-H)^–	243.062 2	243.069 5	0.43	地黄
16	5.869	络氨酸	C₉H₁₁NO₃	(M-H)^–	180.066 4	180.073 9	1.28	地黄
17	9.186	鸟苷	C₁₀H₁₃N₅O₅	(M-H)^–	282.084 1	282.091 7	1.12	地黄
18¹⁾	12.586	地黄苷D	C₂₇H₄₂O₂₀	(M+CHO₂)^–	731.225 6	731.226 9	–0.57	地黄
19¹⁾	14.46	丁香酸	C₉H₁₀O₅	(M-H)^–	197.045 3	197.052 8	1.48	地黄
20	14.562	益母草苷	C₁₅H₂₄O₉	(M+Cl)^–	383.111 1	383.642	0.88	地黄
21	18.189	原儿茶酸	C₇H₆O₃	(M-H)^–	137.024 5	137.031 7	–0.75	夏枯草
22	19.253	2, 3-二氢 -7-甲氧基-4 -甲基 -1H-1, 5 -苯并二氮卓 -2-酮	C₁₁H₁₂N₂O₂	(M-H)^–	203.082 5	203.089 9	0.52	苍术
23	21.839	地黄苦苷	C₁₆H₂₆O₈	(M-H)^–	345.155 3	345.162 8	0.41	地黄
24	22.327	咖啡酸	C₉H₈O₄	(M-H)^–	179.035 1	180.049 5	–0.9	白术
25¹⁾	27.255	异迷迭香酸苷	C₂₄H₂₆O₁₃	(M-H)^–	521.130 8	521.137 3	–1.42	夏枯草
4²⁾	28.487	芦丁	C₂₇H₃₀O₁₆	(M-H)^–	609.146 1	609.153 4	0.08	夏枯草
5²⁾	28.61	槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷	C₂₁H₂₀O₁₂	(M-H)^–	463.088 1	463.095 5	0.26	夏枯草
26¹⁾	30.296	迷迭香酸	C₁₈H₁₆O₈	(M-H)^–	359.077 2	359.084 5	0.18	夏枯草
27¹⁾	38.237	异地黄苷	C₃₁H₄₀O₁₅	(M-H)^–	651.229 1	651.236 7	0.59	地黄
28¹⁾	52.394	表莪术酮	C₁₅H₂₈O₂	(M-H)^–	239.201 4	239.208 9	1.07	莪术
29¹⁾	52.687	肉豆蔻酸	C₁₄H₂₈O₂	(M-H)^–	227.201 7	227.208 9	–0.12	夏枯草
30¹⁾	52.748	熊果酸	C₃₀H₄₈O₃	(M-H)^–	455.353	455.306 3	0.17	夏枯草
31¹⁾	53.606	亚油酸	C₁₈H₃₂O₂	(M-H)^–	279.232 8	279.240 2	0.55	夏枯草
32¹⁾	53.911	软脂酸	C₁₆H₃₂O₂	(M-H)^–	255.233 4	255.240 2	–1.71	夏枯草
33	54.095	油酸	C₁₈H₃₄O₂	(M-H)^–	281.249 0	281.255 9	–1.43	夏枯草
34¹⁾	54.92	硬脂酸	C₁₈H₃₆O₂	(M-H)-	283.264 5	283.271 5	–0.93	苍术
35	33.114	6-0-E阿魏酰基筋骨草醇	C₂₅H₃₂O₁₂	(M-H)^–	523.181 7	523.189 4	0.73	地黄
36	51.355	麝香草酚	C₁₀H₁₄O	(M-H)^–	149.097 1	149.104 5	0.28	夏枯草
37	54.305	11-十八烯酸-	C₁₈H₃₄O₂	(M-H)^–	281.248 6	282.225 9	0.09	夏枯草
注：1)表示负模式下碎片电压160V和260V测得；2)表示正负模式下测得。

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