Synthesis of paclitaxel palmitate and the formulation optimization of its liposomes

CHEN Bingchen; WANG Sizhen; GUO Beibei; YANG Feng

doi:10.12206/j.issn.2097-2024.202404062

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CHEN Bingchen, WANG Sizhen, GUO Beibei, YANG Feng. Synthesis of paclitaxel palmitate and the formulation optimization of its liposomes[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202404062

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CHEN Bingchen, WANG Sizhen, GUO Beibei, YANG Feng. Synthesis of paclitaxel palmitate and the formulation optimization of its liposomes[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202404062

Synthesis of paclitaxel palmitate and the formulation optimization of its liposomes

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202404062

CHEN Bingchen^{1a
,},
WANG Sizhen^1b,
GUO Beibei^1b,
YANG Feng^{1b
,
,}

1a.
1a. Department of Colorectal Surgery, The First Affiliated Hospital, 1b. Department of Inorganic Chemistry, School of Pharmacy, Naval Medical University, Shanghai 200433, China
1b.
1a. Department of Colorectal Surgery, The First Affiliated Hospital, 1b. Department of Inorganic Chemistry, School of Pharmacy, Naval Medical University, Shanghai 200433, China

Received Date: 2024-04-17
Rev Recd Date: 2024-07-18

Abstract

Objective To improve the cellular uptake efficiency and the therapeutic effect of the drug through the structural modification of paclitaxel （PTX） and the preparation of corresponding liposomes. Methods The prodrug of paclitaxel, PTX-PA, was prepared by esterification reaction, and the quantitative detection method of PTX-PA was established. Next,the optimal formulation and preparation of PTX-PA/Lip was obtained through single factor screening based on their appearance, particle size, and encapsulation efficiency. Results The PTX-PA was successfully synthesized, and the established HPLC quantitative analysis method for PTX-PA meet the methodological requirements. After the optimal preparation and formulation research through single factor screening, the particle size of optimized PTX-PA/Lip was （62.75±1.81） nm with a PDI of （0.076±0.02）, while the drug encapsulation rate reached more than 90%. Conclusion This research successfully prepared palmitic acid modified paclitaxel liposomes based on nanotechnology, enhancing the drug delivery efficiency of paclitaxel and laying the foundation for the pharmacodynamics research of PTX-PA.
- paclitaxel,
- palmitic acid,
- liposomes,
- prodrug,
- pharmaceutical research

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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com

1.
沈阳化工大学材料科学与工程学院沈阳 110142

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结直肠癌（CC）发生率占所有肿瘤发生率的第3位，死亡率仅次于肺癌，属于下消化系统恶性肿瘤^[1]。目前，结肠癌的治疗主要采用多学科的综合治疗模式^[2]。包括5-氟尿嘧啶、奥沙利铂与贝伐单抗等的组合^[3-5]。然而，这些常规的化疗方案可能造成患者不耐受以及骨髓等的抑制。因此，寻找新的有效的药物对于现今结肠癌治疗具有重要意义。

紫杉醇（PTX）是一种广谱抗肿瘤活性的化疗药物，来源于太平洋紫杉树皮（红豆杉）^[6,7]。临床试验结果表明，PTX在几种癌症治疗中有较好的活性，包括：乳腺癌、皮肤恶性肿瘤、非小细胞肺癌以及卵巢癌等^[8,9]。然而，由于结肠癌中过表达的P糖蛋白（P-gp）引起了多重耐药性（MDR），导致PTX对结肠癌临床治疗效果不是很理想^[10]。此外，PTX生物半衰期短，其一代药物Taxol以聚氧乙烯蓖麻油为表面活性剂，具有引起患者过敏反应的风险，从而限制了PTX临床疗效的发挥^[11]。因此，迫切需要对PTX进行结构改进与剂型设计，改善其药物递送效率，提高生物利用度^[12]。

脂肪酸作为生物膜和生物信号分子的重要成分，参与了细胞能量产生、代谢的过程。由于肿瘤细胞增殖快速，需要大量的细胞合成物质和能量的供应，因此，患有恶性肿瘤的患者其脂肪酸合成也较快。其中，肿瘤细胞因为迅速繁殖对含有16个碳原子的棕榈酸（PA）为主的脂肪酸需求量大，因此利用PA进行修饰有利于药物被肿瘤细胞摄取^[13,14]。再者，研究发现，由PA修饰的紫杉醇，能降低其对P-gp的亲和力，避免了PTX进入肿瘤细胞后的外排，提高紫杉醇对于结肠癌治疗的有效性^[15]。

此外，作为一种成熟的药物载体，脂质体（Lip）在体内可被降解、无毒性和免疫原性，能够增强药物在体内的稳定性，从而可以减少给药剂量、降低毒副作用，并且其表面具有可修饰性^[16]，例如，采用聚乙二醇磷脂（PEG-DSPE）修饰的脂质体因其空间位阻效应可延长其在体内的循环时间^[17]。同时结合肿瘤组织的增强通透性和滞留效应（EPR），使药物通过被动靶向递送到靶部位^[18]。

结合以上背景，本研究首先通过棕榈酸酯与紫杉醇共价键结合构建紫杉醇棕榈酸酯（PTX-PA），并建立基于高效液相（HPLC）的定量分析方法，旨在降低其对P-gp的亲和力，避免PTX进入肿瘤细胞后被外排，从而改善紫杉醇毒性较大、生物半衰期短、成药性差等问题，提高紫杉醇对于结肠癌治疗的有效性。其次，我们将PTX-PA包载进PEG修饰的脂质体构建紫杉醇棕榈酸酯的脂质体（PTX-PA/Lip），以实现其长循环，增加PTX的疗效、降低其毒副作用。最后，采用工艺筛选与单因素处方优化的方法制备最佳PTX-PA/Lip，为PTX-PA的制剂学研究奠定基础^[19]。

1. 仪器与材料

1.1. 仪器

高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司，美国）；十万分之一电子天平（MS105DU，梅特勒托利多公司，瑞士）；超滤管（30 kD，密理博公司，美国）；低温高速离心机（Eppendorf-200，艾本德公司，德国）；高压均质机（NanoGenizer，美国）；Zeta-sizer Nano粒度仪（Nano-ZS，马尔文公司，英国）。

1.2. 试剂与材料

紫杉醇购自江苏红豆杉生物科技股份有限公司，纯度≥98%；棕榈酸购自中国医药集团上海化学试剂公司，纯度≥99%；蛋黄卵磷脂（PC98-T）、胆固醇、DSPE-PEG 2000均购自上海艾韦特医药科技有限公司；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）、乙酸乙酯、二氯甲烷、无水乙醇、石油醚均购自中国医药集团上海化学试剂公司，分析纯；乙酸乙酯、PC-98T蛋黄卵磷脂（上海艾韦特医药科技有限公司）；胆固醇（上海艾韦特医药科技有限公司）；二氯甲烷、DSPE-PEG 2000（上海艾韦特医药科技有限公司）；无水乙醇、石油醚购自中国医药集团上海化学试剂公司；甲醇购自美国默克公司，色谱纯。

2. 方法

2.1. PTX-PA的制备与纯化

PTX-PA前药由PTX与PA发生酯化反应合成，其合成过程如下^[20,21]：精密称取PTX 0.85 g，加入无水二氯甲烷 30 ml。依次加入精密称取的EDC 0.19 g、DMAP 0.15 g和PA 0.31 g，在氮气保护下室温搅拌反应12 h。反应结束后，用5%柠檬酸水溶液、饱和食盐水洗涤3遍，旋蒸除去有机溶剂，即得PTX-PA粗品。采用石油醚和乙酸乙酯通过柱层析法对PTX-PA进行分离、纯化。洗脱完成后，将产物旋蒸去除有机溶剂，得到的白色固体即为PTX-PA，样品经核磁共振氢谱、碳谱确定为PTX-PA，样品纯度98.5%。

2.2. 基于HPLC定量检测的方法学建立^[22]

2.2.1. 最大吸收波长测定与色谱条件设定

精密取适量的PTX-PA粉末采用甲醇溶解，定容，通过全波长（190~400 nm）扫描测定其紫外最大吸收波长λ_max。

本实验采用Agilent Eclipse plus C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相采用甲醇/水（95∶5，V/V），进样量20 μl，流速1.0 ml/min。

2.2.2. 样品溶液配制

空白溶液的配制：精密量取不含药的空白脂质体1 ml加入适量的甲醇溶液，超声，用甲醇定容至25 ml，0.45 μm的微孔滤膜过滤，滤液即为空白溶液。

对照品溶液的配制：精密称取PTX-PA 粉末50 mg，用甲醇溶解并定容至50 ml，过滤，即得PTX-PA对照品储备溶液。

供试品溶液的配制：精密量取1 ml PTX-PA/Lip，加入适量甲醇溶解、超声破乳、定容至25 ml，过滤，滤液即为供试品溶液。

2.2.3. 专属性考察

分别取适量空白溶液、对照品溶液和供试品溶液，用流动相稀释至适当的浓度后，按照“色谱条件”中建立的高相液相参数进行进样分析。

2.2.4. 线性关系考察

精密量取适量PTX-PA对照品储备液依次稀释为浓度1、5、10、25、50、100 μg/ml的PTX-PA系列浓度。按照“色谱条件”中的高效液相参数进行进样分析（n=5），并记录不同浓度的PTX-PA的色谱峰面积。以浓度（C）为X轴、峰面积（A）为Y轴进行回归。

2.2.5. 精密度考察

日内精密度考察：精密吸取3种不同浓度（5、25、100 μg/ml）的 PTX-PA对照品溶液，对同一浓度溶液连续进样5次，每次10 µl，按照“2.2.1”项下色谱条件进行分析，记录各个浓度吸收峰面积。

日间精密度考察：精密吸取3种不同浓度（5、25、100 μg/ml）的 PTX-PA对照品溶液，对同一浓度溶液连续进样5天，每天1次，每次10 µl，按照“2.2.1”项下色谱条件进行分析，记录第0、1、2、3、4天的吸收峰面积，计算样品浓度，考察仪器的日间精密度。

2.2.6. 重复性与稳定性

空白脂质体超声破乳，配制成3种不同浓度（1、10、100 μg/ml），连续进样5次，每次10 µl，记录各吸收峰面积，考察重复性。精密吸取浓度为50 μg/ml的 PTX-PA供试品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h进样测定，每次进样10 µl，记录各紫外吸收峰面积，考察样品的稳定性。

2.2.7. 加样回收率考察

空白脂质体超声破乳，分别加入浓度为1 mg/ml的PTX-PA溶液0.5、2.5、5 ml，采用流动相稀释定容至100 ml，分别进样，并结合PTX-PA的理论浓度（5、25、50 μg/ml）进行加样回收率的计算与分析。

2.3. 紫杉醇棕榈酸酯脂质体PTX-PA/Lip的制备

2.3.1. PTX-PA/Lip的制备方法的选择

（1）薄膜分散法

精密称取PTX-PA 20 mg、蛋黄卵磷脂350 mg、胆固醇5 mg和DSPE-PEG2000 25 mg，加入适量的二氯甲烷使其充分溶解。然后旋蒸除去有机溶剂，使圆底烧瓶底部形成一层均匀透明的薄膜，再加入预热至同等温度的重蒸水10 ml，震荡、水化，得PTX-PA/Lip粗品。将得到的粗品经探头超声（1 min）、过滤处理后，即得PTX-PA/Lip纳米给药系统^[19]。

（2）高压均质法

将薄膜分散法制得的PTX-PA/Lip粗品置于高压均质机中，经3次均质处理后（均质压力12 000 psi），即得PTX-PA/Lip纳米给药系统^[23,24]。

（3）挤出法

将薄膜分散法制得的PTX-PA/Lip粗品置于挤出器中，使分别经过孔径为0.2、0.1、0.05 μm的聚碳酸酯膜，即得PTX-PA/Lip纳米给药系统^[25-27]。

2.3.2. 处方工艺筛选

（1）磷脂种类的选择

采用薄膜分散法考察不同磷脂制备的PTX-PA/Lip，包括：氢化磷脂（HSPC）、蛋黄卵磷脂（PC98-T）、蛋黄磷脂（EPCS）、二棕榈酸磷脂酰胆碱（DPPC），以形态、粒径、包封率为指标进行评价。

（2）磷脂和药物/胆固醇比例的考察

分别以磷脂和药物的质量比（5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1）/PC98-T和胆固醇的质量比（4∶0.05、4∶0.1、4∶0.2、4∶0.3、4∶0.4、4∶0.5）为自变量制备PTX-PA/Lip脂质体，考察不同处方的粒径、粒径分布、包封率，确定处方中磷脂与药物/胆固醇的质量比。

（3）药物和DSPE-PEG2000比例的考察

以PTX-PA和DSPE-PEG2000的质量比（1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5）为自变量，考察其用量对制剂的外观澄明度、纳米粒子大小等是否产生影响。

（4）薄膜蒸发法的温度考察

将旋转蒸发仪温度分别设置为35、40、45、50、55 ℃，考察薄膜蒸发过程中温度对PTX-PA/Lip形态、粒径、包封率等的影响。

（5）探头超声时间的考察

以探头超声PTX-PA/Lip粗品的时间为自变量，考察不同超声时间（30、60、90、180、240 s）对PTX-PA/Lip纳米制剂形态、纳米粒子大小的影响。

2.4. 统计学分析

数据采用IBM SPSS Statistics 27.0进行统计分析，采用单因素方差分析ANOVA进行显著性检验与评价。

4. 总结

本实验合成紫杉醇前药—紫杉醇棕榈酸酯PTX-PA，建立PTX-PA的HPLC定量测定方法，经一系列方法学验证，表明其符合PTX-PA定量分析要求，为后续试验奠定了基础。本实验采用薄膜分散法制备PTX-PA脂质体，工艺简便，技术成熟，并通过单因素筛选对PTX-PA脂质体进行处方优化。本文基于纳米技术成功制备出棕榈酸修饰的紫杉醇脂质体，增强了紫杉醇在靶细胞的递送，为PTX-PA后续的药效学研究奠定基础。

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	理论浓度（μg/ml）	实测浓度（μg/ml）	RSD（%）
日内	5.00	4.98±0.13	2.65
	25.00	25.30±0.55	2.18
	100.00	99.66±1.11	1.11
日间	5.00	4.99±0.11	2.31
	25.00	25.50±0.57	2.23
	100.00	100.65±1.38	1.37

	理论浓度（μg/ml）	检测浓度（μg/ml）	回收率（%）	RSD（%）
回收率	5	5.02±0.12	100.4	2.39
	25	24.98±0.45	99.92	1.80
	50	50.01±1.17	100.02	2.34

制备方法	粒径（l/nm）	PDI	包封率（%）
薄膜分散法	76.76±3.39	0.104±0.02	79.38±2.00
高压均值法	125.11±5.32	0.139±0.03	78.87±2.00
挤出法	128.87±4.92	0.239±0.05	81.38±1.11

磷脂种类	外观	粒径（l/nm）	PDI	包封率（%）
PC98-T	半透明	76.76±3.39	0.104±0.02	79.38±2.00
HSPC	有沉淀	177.86±5.39	0.532±0.08	59.06±1.32
EPCS	半透明	135.12±5.65	0.108±0.03	73.23±1.15
DPPC	有沉淀	158.26±4.11	0.669±0.05	53.27±2.68

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