Construction and validation of a mouse model with systemic overexpression of human <i>METRNL</i> gene

WANG Xuelian; ZHENG Sili; LI Zhiyong; LUO Hengyu; MIAO Chaoyu

doi:10.12206/j.issn.2097-2024.202311014

Objective To generate mice with whole-body overexpression of human METRNL gene. Methods Based on Cre-loxP system, Dppa3-Cre mice were mated with Rosa26-LSL-METRNL knock-in mice（R26-LSL-METRNL^+/-）to generate R26-L-METRNL^+/- mice. The genotypes of the offsprings were identified, and tissues of the blood, heart, liver, spleen, lung, kidney, brain, white adipose and muscle were collected. The expression of human METRNL gene in mice was investigated by quantitative real-time PCR, western blot and enzyme linked immunosorbent assay. Results Compared with wild type control mice, human METRNL in R26-L-METRNL^+/- mice significantly expressed at both mRNA and protein levels in tissues, with abundant METRNL protein in blood. Conclusion The mouse model overexpressing human METRNL gene（R26-L-METRNL^+/-mouse）was successfully constructed.

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METRNL（Meteorin-like）是一个新发现的分泌蛋白，为神经营养调节因子Meteorin的同源蛋白。2014年，本实验室首次报道METRNL是一个新的脂肪因子，由于其在皮下白色脂肪组织中表达很丰富，故也称为Subfatin^[1]。十年来，我们对METRNL的功能进行了多方面的探索，并不断扩展METRNL的研究工具与平台。我们的研究已发现，该蛋白参与调节机体多种病理生理过程，比如：脂肪细胞METRNL可促进白色脂肪分化、脂质代谢并抑制脂肪炎症，从而抵抗高脂饮食诱导的胰岛素抵抗^[2]；肠上皮细胞METRNL参与调节肠道抗菌肽的平衡^[3]，且肠道METRNL缺乏会加重溃疡性结肠炎^[4]；此外，METRNL促进小鼠皮肤创伤愈合^[5]，并能对抗D-半乳糖诱导的衰老小鼠的认知功能障碍^[6]。最近，我们新报道了血液METRNL的主要分泌来源是血管内皮细胞，并发现内皮细胞METRNL对维持血管内皮正常功能和对抗动脉粥样硬化具有重要作用^[7]。在这些研究中，我们构建了Metrnl基因的全身性和各种组织特异性的敲除小鼠，以及多种双基因敲除小鼠，并在体外细胞实验中充分利用METRNL重组蛋白探索相关治疗学意义。除了本实验室，全球其他多个实验室也展开了对METRNL的功能探索，并发现METRNL在能量代谢^[8-9]、炎症^[10-11]、心脏疾病^[12-13]等多种病理生理过程中发挥积极作用。

尽管目前有很多关于METRNL的研究结果提示，该蛋白具有非常好的临床治疗潜力，但有关整体METRNL治疗学探索不多，尤其是长期治疗研究几乎没有。主要原因之一是市场METRNL重组蛋白价格昂贵，而且我们前期研究结果发现：对C57BL/6J 小鼠单次静脉注射1.75 µg METRNL重组蛋白后，血清METRNL在15 min后急剧升高（226 ng/ml），接着在4 h内迅速下降约90%，虽然在注射后24 h仍明显高于基础水平，但此时血中METRNL浓度已下降约97%^[2]。因此，以重组蛋白给药方式在动物整体水平研究METRNL的治疗学作用，尤其是长期治疗学作用将产生巨大经济成本。另一方面，对于一些已经体现METRNL治疗潜力的疾病如动脉粥样硬化，疾病发展缓慢，短期给予METRNL重组蛋白很难起到治疗作用。

因此，本研究旨在构建一株长期稳定高表达METRNL的小鼠作为METRNL的治疗学研究工具，并对该小鼠高表达METRNL的情况进行验证。

1. 材料与方法

1.1. 实验试剂和仪器

鼠尾DNA提取试剂盒（CW2094S）购自北京康伟试剂生物科技有限公司；5 × PrimeScript RT Master Mix（Takara 公司）；小鼠Tubulin抗体（ AT819）购自碧云天公司；山羊抗兔 IgG（ab175471）、山羊抗小鼠 IgG（ab216772）和Anti-METRNL抗体（ab235775）购自Abcam公司；通用型RNA提取试剂盒II（AG21022）购自艾瑞克生物；Human Meteorin-like/METRNL DuoSet ELISA试剂盒（DY7867-05）购自R&D system公司。

LightCycler96实时荧光定量PCR仪（Roche公司）；TP600PCR仪（Takara公司）；5200S化学发光分析系统（Tanon公司）。

1.2. 实验动物

人METRNL基因条件性过表达（R26-LSL-METRNL^+/-）小鼠为实验室前期构建所得。SPF级8周龄 C57BL/6J 小鼠和Dppa-Cre小鼠购自上海南方模式生物技术有限公司。

所有实验小鼠均饲养在独立通气笼盒（Individual Ventilated Cages，IVC）系统中，温度（24±2）℃，相对湿度为40%~60%，饲养期间笼盒内保持清洁，小鼠在笼内自由活动、进食及饮水，动物房内照明系统为自动控制（12 h照明、12 h黑暗）。动物实验标准均依照国家《实验动物护理使用卫生指南》，并经过海军军医大学大学医学研究伦理委员会批准指导。

1.3. 实验方法

1.3.1. 动物基因型鉴定

将剪刀消毒后剪取小鼠尾尖约3 mm，剪碎，按照DNA提取试剂盒的说明书方法提取DNA之后，对目的基因进行PCR扩增，各引物序列如表1。

基因名称	上游引物（5’→3’）	下游引物（5’→3’）
R26-WT	TCAGATTCTTTTATAGGGGACACA	TAAAGGCCACTCAATGCTCACTAA
R26-L-METRNL	AAAGTCCCGGAAAGGAGCTG	GAGGCTCCATCCAGCAAGTT
R26-Stop	GGGCAACGTGCTGGTTATTG	ACTTGCCCCTTGCTCCATAC
内参基因	TGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGT	GATCCACCTGTCTCTGCCTTCC
Dppa-Cre	TGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGT	GACCTTGCATTCCTTTGGCGAGAG

将PCR产物进行1.2% 琼脂糖凝胶电泳，上样量为每孔6 μl，电泳条件为100 V，30 min，结束后进行拍照、分析。

1.3.2. 小鼠取材

将小鼠称重后，腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液（100 mg/kg），待小鼠处于深度麻醉后，打开其胸腔，自上下腔静脉汇合处缓慢抽取血液，并转移至1.5 ml EP管静置于室温。迅速剪取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、白色脂肪和肌肉组织，放入组织冻存管扔进液氮速冻，待取材结束后及时转入−80 ℃超低温冰箱储存。血液于室温静置2 h后离心：4 ℃，3000×g，15 min，分离血清，储存至−80 ℃超低温冰箱。

1.3.3. 实时荧光定量PCR实验

使用RNA提取试剂盒提取组织RNA，将得到的RNA进行浓度测定与吸光度测定后进行逆转录，得到cDNA用于实时荧光定量PCR实验，各引物序列如表2。

基因名称上游引物（5′—3′）下游引物（5′—3′）

Human METRNL ACCAGCGACTTCGTAATTCAC CAGCTCCACGTCATGGGTG

Mouse Gapdh GTATGACTCCACTCACGGCAAA GGTCTCGCTCCTGGAAGATG

1.3.4. 蛋白免疫印迹实验

取适量组织至2 ml高速离心管，加入蛋白裂解液后，使用高通量匀浆仪匀浆240 s。取出高速离心管，离心：12000 × g，20 min。将上清液转移至另一干净1.5 ml EP管中，进行蛋白浓度测定，剩余样品加入5 × 蛋白上样缓冲液，97 ℃变性10 min得到蛋白样品。

使用10% SDS-PAGE凝胶进行电泳，电泳条件为：150 V，60 min。使用PVDF膜进行转膜，转膜条件为100 V，60 min。

转膜结束后，使用快速封闭液封闭15 min，之后使用1×TBST缓冲液洗膜，5 min × 3次。加入一抗（1∶1000稀释）4 ℃孵育过夜。次日去除一抗孵育液，使用1 × TBST缓冲液洗膜，5 min × 3次。加入二抗孵育液（1∶2 000稀释）常温孵育1 h，用1 × TBST缓冲液洗去二抗，5 min × 4次，结束后即可进行扫膜。

1.3.5. 血清酶联免疫吸附实验

使用酶联免疫吸附实验试剂盒（Human Meteorin-like/METRNL DuoSet ELISA，DY7867-05）测定小鼠血清中的METRNL水平，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.3.6. 统计学分析

实验数据使用GraphPad Prism 8.0进行统计分析。两组间的比较使用双尾t检验，P<0.05视为结果存在统计学意义。

3. 讨论和总结

本研究利用Dppa-Cre小鼠和实验室前期构建的R26-LSL-METRNL^+/-小鼠进行杂交繁殖，最终获得全身过表达人METRNL基因的小鼠，即R26-L-METRNL^+/-小鼠。该小鼠与R26-LSL-METRNL^+/-小鼠都在Rosa26基因位点含有外源性基因表达框，不同的是在R26-L-METRNL^+/-小鼠外源表达框中的终止密码子Stop被Cre酶成功切除，因此R26-L-METRNL^+/-小鼠可实现全身细胞过表达人METRNL。

本研究从mRNA水平、组织蛋白水平和血清蛋白水平考察了R26-L-METRNL^+/-小鼠过表达METRNL的情况。由于该小鼠插入的外源METRNL基因是人METRNL基因，因此在进行实时荧光定量PCR实验时，使用的是人METRNL引物和小鼠Gapdh引物。类似地，在ELISA实验中，使用的是检测人METRNL的试剂盒。由于没有特异性抗人的METRNL抗体，因此在蛋白免疫印迹实验中使用的是可同时抗人和小鼠的METRNL抗体，而内参使用的是抗鼠的Tubulin抗体。本研究结果显示，R26-L-METRNL^+/-小鼠的各组织存在人METRNL mRNA高表达，虽然各组织的表达量有所波动，但都比R26-L-WT小鼠的表达量高几千倍甚至是数十万倍。在蛋白免疫印迹实验中，结果显示在R26-L-METRNL^+/-小鼠的心、肝、脾、肺、肌肉组织存在明显升高的METRNL蛋白水平，但该实验中检测的METRNL蛋白量升高倍数不多，可能与使用的METRNL抗体可以同时抗人和小鼠的METRNL有关。另外，我们也注意到两组小鼠肾组织的METRNL蛋白水平并没有明显差异，并且两组条带都非常微弱，为确证实验结果，我们进行了重复实验，得出相同结果。我们分析可能是因为该METRNL抗体对肾组织蛋白的亲和力不是很高，导致检测出的蛋白绝对量都太低而使两组之间很难出现差异。在血清水平，本研究结果提示R26-L-METRNL^+/-小鼠的血液中存在大量人METRNL蛋白，而R26-L-WT小鼠血中检测不到该蛋白，说明R26-L-METRNL^+/-小鼠成功过表达人METRNL，并可以成功分泌至血液中。同时，该实验提示，本研究所使用的人METRNL ELISA试剂盒特异性比较好，可以清晰区别人和鼠来源的METRNL蛋白。

在小鼠培育过程当中，尚未发现R26-L-METRNL^+/-小鼠和同窝对照WT小鼠在体重、形态等方面有何差异。根据图2中R26-L-METRNL^+/-小鼠的培育方式，采用R26-L-METRNL^+/-小鼠与C57BL/6J 小鼠杂交进行扩大繁殖和保种，基于孟德尔遗传定律，后代鼠中R26-L-METRNL^+/-小鼠理论得率为50%，但实际中，我们发现该小鼠的得率仅仅为15%左右，远低于理论值。这一现象非常有趣，因为此前本实验室构建过多种基因工程动物模型，均没有发现类似偏离孟德尔遗传定律的现象，而这一现象是否与METRNL蛋白的全身性过表达有关，值得我们进一步去研究。

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doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202311014

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1. School of Medicine, Shanghai University, Shanghai 200444, China

2. Department of Pharmacology, Second Military Medical University / Naval Medical University, Shanghai 200433, China