Study on quality standard of Andrographis paniculata standard decoction based on UPLC characteristic chromatogram and quantitative analysis of multi-components by single marker

Waters ACQUITY UPLC® H-Class超高效液相色谱仪、PDA Detector紫外检测器、Empower 3色谱工作站（沃特世科技有限公司）；ME104E电子天平、JY2002电子天平(梅特勒·托利多)；BSA124S电子天平、BT25S电子天平[赛多利斯科技仪器（北京）有限公司]；KQ-500DB超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

穿心莲对照药材（批号：121082-201706）、穿心莲内酯（批号：110797-201609，纯度99.6%）、脱水穿心莲内酯（批号：110854-201710，纯度99.4%）、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷对照品（批号：111968-201602，纯度98%）均购自中国食品药品检定研究院；新穿心莲内酯（批号：RFS-C04911808030，纯度98%）、14-去氧穿心莲内酯（批号RFS-Q09401906015，纯度97.7%）购自成都瑞芬思生物科技有限公司；21批穿心莲药材由北京康仁堂药业有限公司提供，经北京康仁堂药业有限公司质量检测中心鉴定为爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees的干燥地上部分，样品来源见表1，由北京康仁堂药业有限公司按《中国药典》2020年版穿心莲饮片项下的炮制方法加工制成穿心莲饮片。乙腈（MERCK）、磷酸（Fisher Scientific）为色谱纯，甲醇为分析纯，水为屈臣氏纯化水。

取穿心莲饮片200 g，置于砂锅中，浸泡30 min，一煎加入饮片量14倍水，武火（500W）煮沸后，文火（200W）煎煮20 min，趁热用150目滤布过滤，迅速冷却，备用；二煎加饮片量11倍水，同法煎煮15 min，趁热过滤，迅速冷却备用；合并滤液，浓缩（50 ℃以下，真空度-0.1MPa），浓缩至料液比约为1∶1，相对密度为1.05～1.10（50 ℃），冷冻干燥，密封保存，即得。21批标准汤剂（编号D1～D21）由21批饮片一一对应制备（编号S1～S21）。

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC® BEH C₁₈（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0~2 min，10%A；2~5 min，10%→20%A；5~8 min，20%A；8~12 min，20%→29%A；12~19 min，29%→45%A；19~20 min，45%→10%A）；检测波长：211nm；柱温：35 ℃；流速：0.4 ml/min；进样体积：2 μl。

取穿心莲对照药材约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 ml，密塞，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）20 min，放冷，补足减失的重量，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、穿心莲内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷50 μg、穿心莲内酯0.1 mg的混合溶液，作为对照品参照物溶液。

取本品适量，研细，取约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）20 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

取同一供试品溶液（D1）连续进样6次，获得特征图谱，以峰1（木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷）为S1峰，计算峰2、峰3的相对保留时间及相对峰面积，以峰4（穿心莲内酯）为S2峰，计算峰5、峰6、峰7的相对保留时间及相对峰面积，结果显示各特征峰的相对保留时间RSD在0.0%~0.1%范围内，相对峰面积RSD在0.0%~0.5%范围内，表明仪器精密度良好。

取供试品（D1）6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液并测定，结果显示各特征峰的相对保留时间RSD在0.0%~0.4%范围内，相对峰面积在0.0%~2.0%范围内，表明该特征图谱方法重复性较好。

取同一供试品溶液（D1），分别于0、2、4、6、8、16、24 h进样测定，结果显示各特征峰的相对保留时间RSD在0.0%~0.4%范围内，相对峰面积在0.0%~1.1%范围内，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

分别制备21批穿心莲标准汤剂的供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，获得色谱图，将所得数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》软件，采用多点校正将色谱峰自动匹配，中位数法计算获得共有模式，共确定7个共有峰，以峰1（木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷）为S1峰，计算峰2、峰3与S1峰的相对保留时间；以峰4（穿心莲内酯）为S2峰，计算峰5、峰6、峰7与S2峰的相对保留时间；其相对保留时间应在规定值的±10%范围内。规定值为：1.19（峰2）、1.23（峰3）、1.43（峰5）、1.48（峰6）、1.51（峰7），见图1～图3；相似度结果见表2，结果表明，不同批次的穿心莲标准汤剂与对照图谱相似度大于0.90。

按供试品前处理方法，进行穿心莲标准汤剂与药材、饮片的特征图谱相关性分析，全部的特征峰均转移至标准汤剂中，分别将不同批次的穿心莲药材、饮片、标准汤剂的对照指纹图谱进行相似度分析，结果见表3。穿心莲饮片的7个共有峰在穿心莲标准汤剂中有所体现，三者的对照指纹图谱的相似度达到0.90以上，表明穿心莲药材、饮片、标准汤剂指纹图谱非常相似，在化学成分种类上具有一致性，相关性良好，见图4。

取穿心莲内酯、新穿心莲内酯、14-去氧穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含穿心莲内酯0.1 mg、新穿心莲内酯0.1 mg、14-去氧穿心莲内酯0.04 mg、脱水穿心莲内酯0.06 mg的混合对照品溶液，即得。

取穿心莲内酯、新穿心莲内酯、14-去氧穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含穿心莲内酯1.036 mg、新穿心莲内酯0.4610 mg、14-去氧穿心莲内酯0.1750 mg、脱水穿心莲内酯0.3114 mg的对照品混合溶液，作为线性1；分别精密吸取线性1对照品溶液1 ml，置于2、5、10、20 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，依次作为线性2～5的对照品溶液。精密吸取上述线性1～5的续滤液2 μl，注入超高效液相色谱仪测定。以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，进行线性回归，求得回归方程，穿心莲内酯的回归方程为Y=7816583.3841X+66347.2209，r=0.9998，线性范围为0.05180~1.036mg/ml；新穿心莲内酯的回归方程为Y=7007653.8124X+21988.6319，r=0.9999，线性范围为0.02300~0.4610 mg/ml；14-去氧穿心莲内酯的回归方程为Y=9980196.7914X+2394.2039，r=0.9999，线性范围为0.008700~0.1750 mg/ml；脱水穿心莲内酯的回归方程为Y=12848993.2718X+9738.1400，r=0.9999，线性范围为0.01560~0.3114 mg/ml。

精密吸取 “2.3.1”项混合对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，穿心莲内酯、新穿心莲内酯、14-去氧穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯峰面积的RSD值均为0.1%，表明仪器精密度良好。

取同一供试品，按“2.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液（D1），按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，穿心莲内酯、新穿心莲内酯、14-去氧穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯平均含量的RSD分别为0.3%、0.3%、0.4%、0.4%，符合方法学验证重复性要求。

取同一供试品溶液（D1），分别于0、2、4、6、8、16、24 h进样测定，记录穿心莲内酯、新穿心莲内酯、14-去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯峰面积，计算得峰面积RSD值分别为0.5%、0.9%、0.4%、0.5%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

取已知含量的供试品粉末（D1）9份，每份0.10g，精密称定，分别按含有量的50%、100%、150%加入对照品，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液9份，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，计算回收率。所测得穿心莲内酯、新穿心莲内酯、14-去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯平均回收率分别为102.8%、97.4%、97.5%、98.3%，RSD值分别为1.2%、0.9、1.7%、1.3%，符合方法学验证回收率要求。

分别精密吸取不同体积对照品溶液进样5次测定，以穿心莲内酯为内标，按照相对校正因子计算公式，计算新穿心莲内酯、14-去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯与穿心莲内酯之间的相对校正因子，其均值分别为1.22、0.86、0.67(见表4)。

按“2.2.1”项下色谱条件对 “2.3.2”项下混合对照品溶液进行测定，分别考察不同流速、柱温、酸浓度及色谱柱对新穿心莲内酯、14-去氧穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的相对校正因子影响，结果显示，当参照物为穿心莲内酯时，设置不同的柱温和流速, 采用不同品牌的色谱柱、不同浓度的酸性条件时，各成分的相对校正因子的RSD 值都低于3.0%，说明所建立的色谱分析方法的耐用性符合要求，见表5～表8。

取21批穿心莲标准汤剂，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，分别采用一测多评法和外标法计算穿心莲内酯、新穿心莲内酯、14-去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量，RSD均小于3%，结果见表9。说明该一测多评法可用于穿心莲标准汤剂的多成分质量评价。

根据穿心莲各道地产区或主产区质量、道地性及资源可持续性供应等多方面因素，选取广西、广东等两个生产较为集中的产区进行21批次研究用药材样品采集，保证收集的样品规格符合市场常见规格要求，产地年产量不少于5吨。关于穿心莲的药用部位，药典规定为其干燥地上部分，有学者通过比较二萜内酯类成分在穿心莲药材不同部位的分布情况，发现叶中含量最高，其次是茎^[11]。因此药用穿心莲的采集应以叶多的为佳。

利用二极管阵列检测器对对照品溶液和供试品溶液进行全程扫描，确定穿心莲内酯、新穿心莲内酯、14-去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的最大吸收波长均在205~252 nm范围内，综合考虑为使各成分均能有较大吸收，减少溶剂峰影响，提高方法对于不同检测器的适用性，最终选择211 nm作为检测波长，该波长条件下图谱信息丰富，可达到特征图谱及含量测定的检测需求。

本研究采用UPLC建立了穿心莲标准汤剂的特征图谱及一测多评方法，可有效表征其二萜内酯、黄酮类等主要有效成分，极大缩短了检测时间，可为该制剂质量控制及评价提供参考。穿心莲标准汤剂7个特征峰在药材、饮片中均能得到追踪，表明穿心莲标准汤剂与药材、饮片中有效成分的一致性，为该汤剂药效物质研究提供依据。