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应中央军委要求,2022年9月起,《药学实践杂志》将更名为《药学实践与服务》,双月刊,正文96页;2023年1月起,拟出版月刊,正文64页,数据库收录情况与原《药学实践杂志》相同。欢迎作者踊跃投稿!

黑豆,半成品和成品淡豆豉中六种异黄酮含量变化比较

江玥曈 高葱葱 张玉佳 欧炀育 周婷婷

江玥曈, 高葱葱, 张玉佳, 欧炀育, 周婷婷. 黑豆,半成品和成品淡豆豉中六种异黄酮含量变化比较[J]. 药学实践与服务. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202209085
引用本文: 江玥曈, 高葱葱, 张玉佳, 欧炀育, 周婷婷. 黑豆,半成品和成品淡豆豉中六种异黄酮含量变化比较[J]. 药学实践与服务. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202209085
JIANG Yuetong, GAO Congcong, ZHANGYujia, OUYangyu, ZHOUTingting. Comparison of contents variation of six isoflavones in black beans, semifinished and finished Sojae Semen Praeparatum[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202209085
Citation: JIANG Yuetong, GAO Congcong, ZHANGYujia, OUYangyu, ZHOUTingting. Comparison of contents variation of six isoflavones in black beans, semifinished and finished Sojae Semen Praeparatum[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202209085

黑豆,半成品和成品淡豆豉中六种异黄酮含量变化比较

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202209085
详细信息
    作者简介:

    江玥曈,硕士,助教,研究方向:药物分析,E-mail:18221826335@163.com

    通讯作者: 周婷婷,博士,教授,博士生导师,研究方向:中药分析,Email:tingting_zoo@163.com
  • 中图分类号: R917

Comparison of contents variation of six isoflavones in black beans, semifinished and finished Sojae Semen Praeparatum

  • 摘要:   目的  比较发酵前的黑豆及半成品和成品淡豆豉中大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素 6 种异黄酮的含量变化。  方法  采用高效液相色谱法测定异黄酮的含量,色谱条件为DiamonsilC18色谱柱(4.6×250 mm,5 μm),柱温30 ℃,检测波长为260nm,流动相为0.2%醋酸水(A)-甲醇(B),梯度洗脱,流速为1.0ml/min。  结果  该方法测定6种异黄酮成分在测定范围内线性良好(r≥0.9993)且回收率符合要求,精密度实验的RSD小于4%,重复性实验的RSD小于3%,稳定实验的RSD小于3%。检测结果表明,黑豆经发酵后其中的6种异黄酮含量明显提升,且成品淡豆豉比半成品淡豆豉中更多。  结论  本研究建立的高效液相色谱法能够准确测定淡豆豉中6种异黄酮的含量。淡豆豉发酵可提升其中的异黄酮的含量,且在发酵过程中结合型异黄酮向游离型异黄酮苷元转化。
  • 图  1  六种异黄酮HPLC色谱图 (260nm)

    a 空白溶剂;b 对照品; c 黑豆; d 淡豆豉; 1.大豆苷; 2.黄豆黄苷;3.染料木苷; 4.大豆苷元; 5.黄豆黄素; 6染料木素。

    图  2  黑豆、淡豆豉半成品和淡豆豉成品中 6 种异黄酮类成分含量比较

    表  1  大豆苷标准曲线试验结果

    成分回归方程线性范围
    (μg/ml)
    rLOQ
    (μg/ml)
    大豆苷Y=36742X-109991.093~54.650.99990.1093
    黄豆黄苷Y=46941X-147431.018~50.900.99990.1018
    染料木苷Y=49764X-189481.084~54.200.99990.1084
    大豆苷元Y=49161X-146141.018~50.900.99990.1018
    黄豆黄素Y=32743X-8632.11.038~51.900.99930.1038
    染料木素Y=80493X-272000.895~44.750.99990.0895
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    表  2  加样回收率试验结果

    成分药材粉末称量(g)原有量(μg)加入量(μg)测得量(μg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)
    大豆苷0.4923
    0.4956
    0.5001
    0.4927
    0.5004
    0.5012
    63.16
    63.58
    64.16
    63.21
    64.20
    64.30
    64.78
    64.78
    64.78
    64.78
    64.78
    64.78
    121.5
    123.7
    123.2
    121.5
    123.9
    124.4
    90.11
    92.79
    91.20
    90.05
    92.21
    92.70
    91.51


    1.36


    黄豆黄苷0.4923
    0.4956
    0.5001
    0.4927
    0.5004
    0.5012
    18.02
    18.14
    18.31
    18.04
    18.32
    18.35
    18.48
    18.48
    18.48
    18.48
    18.48
    18.48
    37.69
    37.42
    37.81
    37.18
    37.90
    37.82
    106.4
    104.3
    105.5
    103.5
    106.0
    105.3
    105.21.02
    染料木苷0.4923
    0.4956
    0.5001
    0.4927
    0.5004
    0.5012
    110.6
    111.4
    112.4
    110.7
    112.4
    112.6
    113.4
    113.4
    113.4
    113.4
    113.4
    113.4
    215.8
    213.8
    216.4
    213.4
    217.2
    217.2
    92.73
    90.32
    91.64
    90.49
    92.29
    92.22
    91.611.09
    大豆苷元0.4923
    0.4956
    0.5001
    0.4927
    0.5004
    0.5012
    126.0
    126.8
    128.0
    126.1
    128.1
    128.3
    129.2
    129.2
    129.2
    129.2
    129.2
    129.2
    248.7
    247.6
    250.1
    246.7
    250.8
    251.2
    94.94
    93.44
    94.49
    93.31
    95.01
    95.10
    94.380.86
    黄豆黄素0.4923
    0.4956
    0.5001
    0.4927
    0.5004
    0.5012
    29.77
    29.97
    30.24
    29.79
    30.26
    30.31
    30.53
    30.53
    30.53
    30.53
    30.53
    30.53
    58.40
    57.78
    58.05
    57.37
    58.22
    58.44
    93.77
    91.08
    91.10
    90.34
    91.59
    92.16
    91.671.30
    染料木素0.4923
    0.4956
    0.5001
    0.4927
    0.5004
    0.5012
    127.2
    128.0
    129.2
    127.2
    129.2
    129.4
    130.4
    130.4
    130.4
    130.4
    130.4
    130.4
    254.0
    253.8
    256.9
    253.4
    257.9
    257.8
    97.25
    96.43
    97.98
    96.75
    98.69
    98.40
    97.580.94
    下载: 导出CSV

    表  3  黑豆、发酵中和发酵后的淡豆豉中 6 种异黄酮类成分含量比较

    成分 (μg/g)大豆苷黄豆黄苷染料木苷大豆苷元黄豆黄素染料木素
    黑豆73.4420.58128.285.9930.4592.48
    半成品淡豆豉88.7825.29211.6213.9249.10239.7
    成品淡豆豉123.644.02217.0239.356.75245.4
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  • [1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典 2020 年版 (一部) [S]. 北京: 中国医药科技出版社, 2020: 350.
    [2] 陈丽艳, 官雪莲, 张蕾, 等. 淡豆豉对人体肠道六种常住菌的调节作用[J]. 中国微生态学杂志, 2017, 29(10):1122-1126.
    [3] 胡斌, 王秋红, 姜海, 等. 淡豆豉抗菌活性及化学成分分析[J]. 中国实验方剂学杂志, 2019, 25(6):163-167.
    [4] 曹冬英, 李鸷, 许文, 等. 4种市售黑豆及成品淡豆豉中异黄酮含量分析[J]. 药学研究, 2020, 39(10):581-584.
    [5] 李鸷, 曹冬英, 许文, 等. 基于发酵过程的淡豆豉6种黄酮类成分质量控制研究[J]. 药学研究, 2019, 38(10):563-566,573.
    [6] 田赛赛, 何金城, 韩燕, 等. 大豆及其发酵品的活性成分研究进展[J]. 药学服务与研究, 2016, 16(1):15-18.
    [7] GUO H, ZHANG Z, YAO Y, et al. A new strategy for statistical analysis-based fingerprint establishment: application to quality assessment of Semen sojae praeparatum[J]. Food Chem,2018,258:189-198. doi:  10.1016/j.foodchem.2018.03.067
    [8] YAOY, MAX, LI T, et al. Quantification of isoflavone glycosides and aglycones in rat plasma by LC-MS/MS: Troubleshooting of interference from food and its application to pharmacokinetic study of Semen Sojae Praeparatum extract[J]. J Pharm Biomed Anal,2018,161:444-454. doi:  10.1016/j.jpba.2018.09.011
    [9] 张景, 冯亭亭, 张明柱. 淡豆豉中异黄酮含量测定及其抑制乙酰胆碱酯酶活性研究[J]. 天然产物研究与开发, 2017, 29(2):310-315.
    [10] 廖丽娜, 张明敏, 曹尉尉, 等. 淡豆豉药材的高效液相指纹图谱研究[J]. 药学实践杂志, 2012, 30(5):351-352,386.
    [11] QULP, FANG R, PENG J Y, et al. Isolation of six isoflavones from semen soja epraeparatum by preparative HPLC[J]. Fitoterapia,2007,78(3):200-204. doi:  10.1016/j.fitote.2006.11.002
    [12] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典 2020 年版 (四部) [S]. 北京: 中国医药科技出版社, 2020: 480.
    [13] CHANGRR, LIUJ L, LUO Y S, et al. Isoflavones' effects on pharmacokinetic profiles of main iridoids from Gardeniae Fructus in rats[J]. J Pharm Anal,2020,10(6):571-580. doi:  10.1016/j.jpha.2019.11.004
    [14] 董雨薇, 刘学, 薛晓欣, 等. 浅谈黑豆萌发过程中营养成分的变化[J]. 广东蚕业, 2019, 53(06):25-26.
  • [1] 任丹, 齐方圆, 黄紫妍, 秦路平, 朱波.  15个产地玄参中哈巴苷与哈巴俄苷含量测定 . 药学实践与服务, doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202008102
    [2] 张圳, 冯家懿, 果卉, 姚媛, 闻俊, 周婷婷.  高效液相色谱法测定体外大鼠肠道菌液中大豆苷及其代谢物 . 药学实践与服务, doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.2018.04.013
    [3] 陈亮, 李卿, 陈军峰, 冯婧娴, 张磊, 陈万生.  催化菘蓝活性木脂素生物合成的漆酶基因家族生物信息学分析 . 药学实践与服务, doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.2017.03.005
    [4] 蒋益萍, 薛黎明, 辛海量, 张巧艳, 秦路平.  AB-8大孔树脂纯化五味子木脂素工艺研究 . 药学实践与服务, doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.2017.06.010
    [5] 郑峰, 阙晓, 苏靖, 丁丽燕, 聂曲, 邱明丰.  HPLC法和UV法测定复方枣参片中斯皮诺素和总皂苷含量 . 药学实践与服务, doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.2017.02.009
    [6] 贾家丽, 黄月英, 卞俊.  芍药苷胃漂浮片的制备 . 药学实践与服务, doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.2016.02.014
    [7] 曹尉尉, 徐江平, 赵娜萍, 王晶, 张黎.  积雪草总苷元对慢性应激抑郁大鼠的影响 . 药学实践与服务, doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.2012.02.012
    [8] 赵楠, 刘丹, 王艳萍, 王金凤, 魏颖.  HPLC法测定葛花中鸢尾苷和鸢尾苷元的含量 . 药学实践与服务, doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.2012.03.020
    [9] 廖丽娜, 张明敏, 曹尉尉, 毛峻琴.  淡豆豉药材的高效液相指纹图谱研究 . 药学实践与服务, doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.2012.05.009
    [10] 蔡飞, 王维泓, 高守红, 陈万生.  知母皂苷及其苷元的药理作用研究进展 . 药学实践与服务,
    [11] 李悦悦, 王慧, 陈俊, 赵亮, 张海, 张国庆.  HPLC法测定防风中升麻苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的含量 . 药学实践与服务,
    [12] 何厚罗, 黄章倍, 盛佳钰, 岳小强, 李敏, 辛海量.  人参茎叶总皂苷中人参皂苷Re的含量分析 . 药学实践与服务,
    [13] 廖洪利, 苏春丽, 胡小兰, 臧志和, 王静.  芒果苷药理研究新进展 . 药学实践与服务,
    [14] 张岚, 杨水新.  五味子配方颗粒中木脂素成分分析 . 药学实践与服务,
    [15] 毛俊琴, 李铁军, 邱彦, 芮耀诚, 顾正兵.  糙叶败酱中环烯醚萜苷元成分抗结肠癌作用的实验研究 . 药学实践与服务,
    [16] 曲丽萍, 宓鹤鸣, 范国荣.  大豆异黄酮提取与纯化方法研究进展 . 药学实践与服务,
    [17] 李宝德, 高晓旭.  不同产地穿山龙薯蓣皂苷元含量的比较研究 . 药学实践与服务,
    [18] 周永刚, 黄晟, 谷莉, 王彬, 张国庆, 娄子洋.  HPLC法测定知母药材中芒果苷和新芒果苷的含量 . 药学实践与服务,
    [19] 高守红, 杨少麟, 范国荣.  虎杖苷的研究进展 . 药学实践与服务,
    [20] 孙奎, 姜华.  玄参中苯丙素苷对肝细胞损伤保护作用的研究 . 药学实践与服务,
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出版历程
  • 收稿日期:  2022-09-30
  • 修回日期:  2022-11-08

黑豆,半成品和成品淡豆豉中六种异黄酮含量变化比较

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202209085
    作者简介:

    江玥曈,硕士,助教,研究方向:药物分析,E-mail:18221826335@163.com

    通讯作者: 周婷婷,博士,教授,博士生导师,研究方向:中药分析,Email:tingting_zoo@163.com
  • 中图分类号: R917

摘要:   目的  比较发酵前的黑豆及半成品和成品淡豆豉中大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素 6 种异黄酮的含量变化。  方法  采用高效液相色谱法测定异黄酮的含量,色谱条件为DiamonsilC18色谱柱(4.6×250 mm,5 μm),柱温30 ℃,检测波长为260nm,流动相为0.2%醋酸水(A)-甲醇(B),梯度洗脱,流速为1.0ml/min。  结果  该方法测定6种异黄酮成分在测定范围内线性良好(r≥0.9993)且回收率符合要求,精密度实验的RSD小于4%,重复性实验的RSD小于3%,稳定实验的RSD小于3%。检测结果表明,黑豆经发酵后其中的6种异黄酮含量明显提升,且成品淡豆豉比半成品淡豆豉中更多。  结论  本研究建立的高效液相色谱法能够准确测定淡豆豉中6种异黄酮的含量。淡豆豉发酵可提升其中的异黄酮的含量,且在发酵过程中结合型异黄酮向游离型异黄酮苷元转化。

English Abstract

江玥曈, 高葱葱, 张玉佳, 欧炀育, 周婷婷. 黑豆,半成品和成品淡豆豉中六种异黄酮含量变化比较[J]. 药学实践与服务. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202209085
引用本文: 江玥曈, 高葱葱, 张玉佳, 欧炀育, 周婷婷. 黑豆,半成品和成品淡豆豉中六种异黄酮含量变化比较[J]. 药学实践与服务. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202209085
JIANG Yuetong, GAO Congcong, ZHANGYujia, OUYangyu, ZHOUTingting. Comparison of contents variation of six isoflavones in black beans, semifinished and finished Sojae Semen Praeparatum[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202209085
Citation: JIANG Yuetong, GAO Congcong, ZHANGYujia, OUYangyu, ZHOUTingting. Comparison of contents variation of six isoflavones in black beans, semifinished and finished Sojae Semen Praeparatum[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202209085
  • 黑豆是由豆科植物大豆[Glycine max (Linn.) Merr.]的成熟种子,淡豆豉是由黑豆经发酵后加工而成[1]。淡豆豉的性味苦且辛凉,具有解表、除烦和清解郁热的功效,可用于治疗头痛感冒、胸闷烦躁、失眠等症状。淡豆豉中含有异黄酮、多糖、氨基酸、蛋白、皂苷、纤溶酶等主要成分,其中广泛认为异黄酮类成分是主要活性成分之一。经研究发现,淡豆豉还具有抗细菌、降低血糖、调节肠道菌群及抗癌等药理活性[2-6]

    本课题组按照前期优化的发酵工艺自制淡豆豉,并建立了通过高效液相色谱对淡豆豉中六种异黄酮进行含量测定的方法[7-8]。依据建立的分析方法对发酵前的黑豆和发酵后的半成品和成品淡豆豉中六种异黄酮的含量进行检测,分析比较了淡豆豉发酵前后和不同程度发酵条件下淡豆豉中六种异黄酮的含量变化,为后续课题组进一步完善淡豆豉的发酵工艺和深入研究淡豆豉中异黄酮类化合物的药理活性奠定了研究基础。

    • SHIMAZULC-20ADXR高效液相色谱仪(日本岛津制作所),KQ-800DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),Sartorius SQP型电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司),YF103-200G高速中药粉碎机(瑞安市永历制药机械有限公司),DHG9420电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司),AnkeTDL-2B台式低速离心机(济南存昌生物技术有限公司),Hitech Smart-S15纯水仪(上海和泰仪器有限公司)

    • 大豆苷对照品(批号AZ21091701)、黄豆黄苷对照品(批号AZ22052701) 、染料木苷对照品(批号AZ21090901) 、大豆苷元对照品(批号AZ21102201)、黄豆黄素对照品(批号AZ22061011) 、染料木素对照品(批号AZ21101501),均购于成都埃法生物科技有限公司。甲醇和冰醋酸为色谱纯(默克股份两合公司,德国) 。黑豆购买于安徽亳州神农谷药材商品交易中心,经海军军医大学药学系辛海量教授鉴定为豆科植物大豆的成熟种子。淡豆豉为本实验室发酵而成。

    • 淡豆豉为本实验室发酵而成,根据《中国药典》中淡豆豉的制作标准[1],按质量比1∶1∶10称量青蒿、桑叶和黑豆,用量筒量取青蒿桑叶总质量的8倍水,将青蒿、桑叶倒入圆底烧瓶中,加入量好的水,冷凝回流煎煮1 h,将煎煮好的中药用尼龙纱布过滤,药渣放入托盘中,滤液倒入烧杯中。将处理后的黑豆放入滤液中,浸泡16 h。取出黑豆,放入蒸煮锅蒸煮1 h。晾约1 h至黑豆表面基本干燥,之后放入烧杯中,将一定量的半干半湿的青蒿桑叶置于黑豆上层,覆盖1.5 cm,置于35 ℃,湿度50%的恒温培养箱中发酵6天后取出一半,做为半成品淡豆豉样品。剩余一半清洗稍晾后继续放入烧杯中,上层覆盖干燥的混匀后的青蒿、桑叶,置于35 ℃,湿度50%的恒温培养箱继续发酵15天,即为成品淡豆豉样品。

    • 精密称取对照品大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素适量10.93 mg、10.18 mg、10.84 mg、 5.09 mg、5.19 mg、8.95 mg,加入甲醇超声溶解,于10 ml容量瓶内定容;制成浓度分别为1093 μg/ml、1018 μg/ml、1084 μg/ml、509 μg/ml、519 μg/ml和895 μg/ml的单一对照品储备液,再分别精密量取六种异黄酮对照品储备液适量,用甲醇稀释,配制成一系列浓度的混合对照品溶液[9-10]

    • 将黑豆及自制淡豆豉样品60 ℃干燥,粉碎,过四号筛。取样品粉末约0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入10 ml色谱甲醇,混匀,超声处理2 h,放冷,再次称重,甲醇补足减失重,摇匀,进样前用0.45 μm滤膜滤过,取续滤液,得供试品溶液。

    • 色谱柱:DiamonsilC18(4.6×250 mm,5 μm);流动相为0.2%醋酸水(A)-甲醇(B),梯度洗脱(0~6 min,20%B;6~7 min,20%~40%B;7~12 min,40%B;12~22 min,40%~60%B;22~27 min,60%B;27~35 min,60%~90%B;35~40 min,90%B;40~41 min,90%~20%B;41~45 min,20%B),流速:1.0 ml/min;柱温:30 ℃;检测波长:260 nm;进样量:10 μl。空白溶剂、对照品、黑豆和淡豆豉样品色谱峰如图1所示。大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素的保留时间依次为16.72 min、17.56 min、20.63 min、27.40 min、28.03 min和30.95 min。

      图  1  六种异黄酮HPLC色谱图 (260nm)

    • 分别精密量取“2.1”项下对照品储备液溶液适量,置同一10ml容量瓶中,加50%甲醇至刻度,即得大豆苷54.65 μg/ml、黄豆黄苷50.90 μg/ml、染料木苷54.20 μg/ml、大豆苷元50.90 μg/ml、黄豆黄素51.90 μg/ml和染料木素44.75 μg/ml混合对照品溶液。取混合对照品溶液加50%甲醇进行逐级稀释,制成系列浓度的混合对照品溶液,进样分析。将信噪比大于且接近于10的对照品溶液浓度作为定量限(LOQ)。对于高于定量限的系列浓度的混合对照品溶液,以峰面积(Y)为纵坐标,浓度(X)为横坐标进行线性回归,得到大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的标准曲线。结果显示 6 种化学成分在相应浓度范围内呈现良好线性关系。

      表 1  大豆苷标准曲线试验结果

      成分回归方程线性范围
      (μg/ml)
      rLOQ
      (μg/ml)
      大豆苷Y=36742X-109991.093~54.650.99990.1093
      黄豆黄苷Y=46941X-147431.018~50.900.99990.1018
      染料木苷Y=49764X-189481.084~54.200.99990.1084
      大豆苷元Y=49161X-146141.018~50.900.99990.1018
      黄豆黄素Y=32743X-8632.11.038~51.900.99930.1038
      染料木素Y=80493X-272000.895~44.750.99990.0895
    • 取浓度分别为低、中、高的对照品溶液在同一天内连续重复进样3次,以峰面积计算3次结果的RSD值。低浓度对照品中大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素峰面积结果的RSD值分别为1.83%、0.39%、1.56%、1.45%、2.89%、0.59%;中浓度对照品中六种异黄酮成分峰面积结果的RSD值分别为0.08%、0.05%、0.05%、0.01%、0.41%、0.07%;高浓度对照品中六种异黄酮成分面积结果的RSD值分别为0.48%、0.42%、0.38%、0.44%、1.10%、0.59%。结果表明,此方法的日内精密度良好。

      取浓度分别为低、中、高的对照品溶液连续3天进样检测,以峰面积计算3次结果的RSD值。低浓度对照品中大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素峰面积结果的RSD值分别为0.13%、3.72%、3.52%、2.33%、2.15%、1.18%;中浓度对照品中六种异黄酮成分峰面积结果的RSD值分别为2.46%、2.61%、2.58%、2.28%、1.06%、1.81%;高浓度对照品中六种异黄酮成分面积结果的RSD值分别为3.44%、3.62%、3.70%、3.37%、3.08%、2.98%。结果表明,此方法的日间精密度良好。

    • 取同一批自制淡豆豉按上述条件制备 6 份供试品溶液,按“2.3”项下色谱条件进样测定, 6种异黄酮大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的平均含量分别为124.2 μg/g、37.11 μg/g、252.5 μg/g、273.4 μg/g、58.65 μg/g、283.3 μg/g,并计算含量的RSD值分别为1.89%、1.79%、2.50%、2.04%、2.51%、2.67%,结果表明该方法的重复性良好。

    • 取同一批自制淡豆豉的供试品溶液,在制备后0、2h、4h、6h、8h按“2.3”项下色谱条件进样测定。测定 6 种异黄酮的峰面积,计算大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、黄豆苷元、黄豆黄素、染料木素的峰面积的RSD 值,结果分别1.93%、2.43%、0.94%、0.88%、1.01%、0.89%,结果表明供试品溶液在室温下放置8h的稳定性良好。

    • 取重复性试验同批次淡豆豉粉末约0.5 g,精密称定,平行6份,分别置于具塞锥形瓶中,每份分别精密加入近似等量的 6种对照品溶液,精密加入色谱甲醇至10 ml,混匀,超声处理2h,放冷,再次称重,甲醇补足减失重,摇匀,进样前用0.45 μm滤膜滤过,取续滤液,得加样回收供试品溶液。按上述色谱条件测定各成分的峰面积,计算各个化合物的回收率和回收率的RSD值,结果见表2。结果表明该方法回收率良好。

      表 2  加样回收率试验结果

      成分药材粉末称量(g)原有量(μg)加入量(μg)测得量(μg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)
      大豆苷0.4923
      0.4956
      0.5001
      0.4927
      0.5004
      0.5012
      63.16
      63.58
      64.16
      63.21
      64.20
      64.30
      64.78
      64.78
      64.78
      64.78
      64.78
      64.78
      121.5
      123.7
      123.2
      121.5
      123.9
      124.4
      90.11
      92.79
      91.20
      90.05
      92.21
      92.70
      91.51


      1.36


      黄豆黄苷0.4923
      0.4956
      0.5001
      0.4927
      0.5004
      0.5012
      18.02
      18.14
      18.31
      18.04
      18.32
      18.35
      18.48
      18.48
      18.48
      18.48
      18.48
      18.48
      37.69
      37.42
      37.81
      37.18
      37.90
      37.82
      106.4
      104.3
      105.5
      103.5
      106.0
      105.3
      105.21.02
      染料木苷0.4923
      0.4956
      0.5001
      0.4927
      0.5004
      0.5012
      110.6
      111.4
      112.4
      110.7
      112.4
      112.6
      113.4
      113.4
      113.4
      113.4
      113.4
      113.4
      215.8
      213.8
      216.4
      213.4
      217.2
      217.2
      92.73
      90.32
      91.64
      90.49
      92.29
      92.22
      91.611.09
      大豆苷元0.4923
      0.4956
      0.5001
      0.4927
      0.5004
      0.5012
      126.0
      126.8
      128.0
      126.1
      128.1
      128.3
      129.2
      129.2
      129.2
      129.2
      129.2
      129.2
      248.7
      247.6
      250.1
      246.7
      250.8
      251.2
      94.94
      93.44
      94.49
      93.31
      95.01
      95.10
      94.380.86
      黄豆黄素0.4923
      0.4956
      0.5001
      0.4927
      0.5004
      0.5012
      29.77
      29.97
      30.24
      29.79
      30.26
      30.31
      30.53
      30.53
      30.53
      30.53
      30.53
      30.53
      58.40
      57.78
      58.05
      57.37
      58.22
      58.44
      93.77
      91.08
      91.10
      90.34
      91.59
      92.16
      91.671.30
      染料木素0.4923
      0.4956
      0.5001
      0.4927
      0.5004
      0.5012
      127.2
      128.0
      129.2
      127.2
      129.2
      129.4
      130.4
      130.4
      130.4
      130.4
      130.4
      130.4
      254.0
      253.8
      256.9
      253.4
      257.9
      257.8
      97.25
      96.43
      97.98
      96.75
      98.69
      98.40
      97.580.94
    • 用上述建立的方法对发酵前的黑豆、发酵中的半成品淡豆豉和发酵后的成品淡豆豉中六种异黄酮的含量进行检测,每个样品平行测定3次,计算3次检测结果的平均值,并对检测结果比较。结果见表3

      表 3  黑豆、发酵中和发酵后的淡豆豉中 6 种异黄酮类成分含量比较

      成分 (μg/g)大豆苷黄豆黄苷染料木苷大豆苷元黄豆黄素染料木素
      黑豆73.4420.58128.285.9930.4592.48
      半成品淡豆豉88.7825.29211.6213.9249.10239.7
      成品淡豆豉123.644.02217.0239.356.75245.4

      将上述结果用柱形图表示,如图2

      图  2  黑豆、淡豆豉半成品和淡豆豉成品中 6 种异黄酮类成分含量比较

    • 4.1 本实验建立了一种通过高效液相色谱法对黑豆及发酵淡豆豉中的六种异黄酮成分进行含量检测的分析方法,并对建立的分析方法进行了系统性的方法学验证。从图1中可以看出,该方法能够检测出黑豆及淡豆豉中的大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素这六种异黄酮成分,且空白溶剂对检测无影响。说明该高效液相色谱分析方法专属性良好,适用于本实验发酵工艺下的淡豆豉中异黄酮的含量测定。经线性、精密度、重复性、稳定性和加样回收率试验考察,该分析方法检测六种异黄酮的含量线性关系良好,较为精密和稳定,回收率符合《中国药典》规定标准[11-12]。其中,大豆苷、染料木苷和黄豆黄素的回收率偏低,可能的原因是这三种化合物的稳定性较差,易分解或转化,也可能是在浓缩等预处理过程中由于溶解度偏低的原因导致化合物一定程度上的损失。

      4.2 通过上述分析方法对发酵前的黑豆和课题组自制的半成品淡豆豉及成品淡豆豉进行含量测定,并对检测出的含量进行比较。根据图2所示结果可以发现,发酵后的淡豆豉中六种异黄酮的含量相较于未发酵的黑豆有显著性提升。其中,相较于大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷等结合型糖苷,大豆苷元、黄豆黄素和染料木素等游离型苷元的增长更加明显。而且,半成品淡豆豉与成品淡豆豉中的异黄酮含量相比较,成品淡豆豉中的六种异黄酮的含量均较高,其中大豆苷、黄豆黄苷、大豆苷元这三种异黄酮的含量增多较为明显。从整体趋势来看,在黑豆发酵成半成品淡豆豉再至成品淡豆豉的过程中,这六种异黄酮的含量逐渐增多,其中黑豆发酵为淡豆豉后其中的异黄酮含量显著升高,然后随着发酵时间的延长淡豆豉中的异黄酮含量缓慢攀升。

      大豆异黄酮多以结合型糖苷的形式存在,一般认为结合型的糖苷是无活性的,大量研究表明,异黄酮苷元具有较强的生物活性[13]。所以,上述结果可以表明,黑豆经过发酵成淡豆豉后其生物活性有明显提升。另外,黑豆在发酵过程中,其中的6种异黄酮成分的含量持续增多,随着发酵时间的推移异黄酮含量提升变缓。这种趋势的原因可能是黑豆发酵过程中随着呼吸作用的增强,酶的含量升高,使得异黄酮的生物合成的关键酶—苯丙氨酸氨基裂解酶(PAL)含量也因此提高,发酵后的淡豆豉中的异黄酮的含量随之提高,然而随着发酵时间的延长呼吸作用的增强变缓[14]

参考文献 (14)

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