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靶向BRD4的ATTECs设计、合成与蛋白降解活性研究

周洛竹 盛春泉

周洛竹, 盛春泉. 靶向BRD4的ATTECs设计、合成与蛋白降解活性研究[J]. 药学实践与服务. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202206050
引用本文: 周洛竹, 盛春泉. 靶向BRD4的ATTECs设计、合成与蛋白降解活性研究[J]. 药学实践与服务. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202206050
ZHOU Luozhu, SHENG Chunquan. Design, Synthesis and Degradation Activity of BRD4-targeting ATTECs[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202206050
Citation: ZHOU Luozhu, SHENG Chunquan. Design, Synthesis and Degradation Activity of BRD4-targeting ATTECs[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202206050

靶向BRD4的ATTECs设计、合成与蛋白降解活性研究

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202206050
详细信息
    作者简介:

    周洛竹,硕士研究生,Email:532845727@qq.com

    通讯作者: 盛春泉,博士,教授,博士研究生导师,研究方向:抗真菌和抗肿瘤药物研究,Tel:(021)81871238,Email:shengcq@smmu.edu.cn

Design, Synthesis and Degradation Activity of BRD4-targeting ATTECs

图(6)
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出版历程
  • 收稿日期:  2022-06-13
  • 修回日期:  2022-10-10
  • 网络出版日期:  2022-12-22

靶向BRD4的ATTECs设计、合成与蛋白降解活性研究

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202206050
    作者简介:

    周洛竹,硕士研究生,Email:532845727@qq.com

    通讯作者: 盛春泉,博士,教授,博士研究生导师,研究方向:抗真菌和抗肿瘤药物研究,Tel:(021)81871238,Email:shengcq@smmu.edu.cn

摘要:   目的  基于自噬小体绑定化合物(ATTEC)策略,设计并合成靶向BRD4的自噬降解剂,验证其降解活性。  方法  以化合物ispinesib为LC3配体,通过不同长度的linker与化合物JQ1相连,产物结构经1H NMR、13C NMR与 ESI-MS确证,并使用Western Blot技术测试其在不同细胞系中诱导BRD4降解活性。  结果  获得5个首次报道的BRD4-ATTEC分子,化合物 4 在不同细胞系中显示出一定的BRD4降解活性。  结论  本研究发现了新型BRD4自噬降解剂,拓展了靶向自噬降解的适用范围。

English Abstract

周洛竹, 盛春泉. 靶向BRD4的ATTECs设计、合成与蛋白降解活性研究[J]. 药学实践与服务. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202206050
引用本文: 周洛竹, 盛春泉. 靶向BRD4的ATTECs设计、合成与蛋白降解活性研究[J]. 药学实践与服务. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202206050
ZHOU Luozhu, SHENG Chunquan. Design, Synthesis and Degradation Activity of BRD4-targeting ATTECs[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202206050
Citation: ZHOU Luozhu, SHENG Chunquan. Design, Synthesis and Degradation Activity of BRD4-targeting ATTECs[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202206050
  • 蛋白降解靶向嵌合体(proteolysis targeting chimera, PROTAC)是近年来最受期待的蛋白降解技术[1]。PROTAC是一种异双功能分子,一端与靶蛋白结合,另一端结合E3连接酶形成靶蛋白-PROTAC-E3三元复合物,E3连接酶诱导靶蛋白泛素化,随后被蛋白酶体识别并降解。PROTAC相较传统药物具有诸多优势,如使难成药靶点实现可成药性、大幅增加可用靶点数量、克服耐药性、提高选择性和活性、降低毒副作用等。但是,PROTAC依赖E3连接酶和蛋白酶体,也存在一些固有缺陷,如主要针对细胞质中可溶性蛋白进行降解,不能降解蛋白聚集物和大的蛋白质,对非蛋白物质的降解无能为力[2]

    自噬-溶酶体途径(ALP)是广泛存在于真核细胞中的蛋白降解系统,它是指在自噬关键蛋白LC3参与下,细胞内膜结构形成自噬小体并将底物包裹,随后转运至溶酶体实现底物降解的过程[3]。该机制涉及的底物范围十分广泛,包括蛋白质聚集体、衰老或受损的细胞器、入侵的病原微生物等。ALP与泛素-蛋白酶体途径互为补充,在细胞中发挥重要的生理功能[4-5]

    2019年,复旦大学鲁伯埙团队基于自噬-溶酶体途径首次提出自噬小体绑定化合物(, ATTEC)概念。ATTEC是一种双功能分子,同时结合LC3与靶蛋白,将靶蛋白包裹进自噬小体,并在溶酶体中实现降解。基于这一思想,研究人员将小分子库固定在芯片上,筛选以“分子胶”方式将突变型亨廷顿蛋白(mHTT)和LC3蛋白“黏合”的分子,成功获得4个小分子化合物(10O5、ispinesib、AN1-2, 图1)。这些化合物能有效降解mHTT蛋白,并减弱亨廷顿病相关表型[6]。ATTEC分子通过直接连接自噬蛋白LC3,绕过泛素化过程,是一种利用自噬降解靶标最为直接的策略,对于降解不同类型的靶标具有很大的潜力。但是,ATTEC技术尚处于概念验证阶段,急需拓展靶标应用范围,推动技术的不断成熟。

    图  1  ATTEC分子胶化学结构

    BRD4是BET溴结构域蛋白家族中最重要的成员之一,在人体中广泛分布,对细胞正常生长及细胞周期的调控具有重要意义,与肿瘤发生密切相关,是肿瘤治疗的热门靶点[7],基于PROTAC的BRD4降解剂相继报道[8-9]。BRD4已成为靶向蛋白降解研究的经典体系,为了验证ATTEC降解策略的普适性和可行性,我们以BRD4靶点为研究对象,开展BRD4-ATTEC分子设计、合成和蛋白降解活性评价研究。

    • BRD4-ATTEC分子由三部分组成:BRD4抑制剂、连接子Linker和LC3配体。我们选择经典BRD4抑制剂JQ1作为靶蛋白配体,JQ1与BRD4共晶结构如图2A所示。JQ1的酯基部分暴露于溶剂中,适合作为Linker连接位点,不影响BRD4蛋白结合活性[10];Ispinesib作为LC3配体,由于鲁伯埙团队在进行高通量筛选时,化合物ispinesib的氨基端连接于分子芯片,故选择氨基端作为Linker连接另一位点,不会影响其与LC3蛋白的结合;随后,使用不同长度的烷烃链将两个配体相连设计得到相应目标化合物(图2BC)。目标化合物通过同时结合BRD4与LC3蛋白,将BRD4靶向至自噬小体中,从而被溶酶体吞噬完成降解。

      图  2  BRD4 自噬降解设计

    • 化学原料均为市售分析纯;rabbit anti-Brd4 antibody (Abcam,ab128874);rabbit anti-GAPDH antibody (Abcam,ab181602);goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor® 680) (Abcam,ab175773);Bruker AVANCE600(Bruker Company, Germany)核磁共振仪,TMS作为内标,化学位移与偶合常数分别用ppm和Hz表示;Agilent 6538 UHD Accurate-Mass Q-TOF LC/MS高分辨质谱(HRMS)仪;上海申光WRR目视熔点仪;Bioteck Synergy2多功能酶标仪;Biorad ChemiDoc成像仪。

    • 图  3  化合物4合成路线

      S)-5-(2-(4-(4-氯苯基)-2, 3, 9-三甲基-6H-噻吩并[3, 2-f][1, 2, 4]三唑并[4, 3-a][1, 4]二氮杂卓-6-基)乙酰氨基)戊酸甲酯(2)的制备:

      将JQ1-1(100 mg,0.25 mmol)溶解于二氯甲烷(DCM, 10 ml)中,加入5-氨基戊酸甲酯(1,39 mg,0.30 mmol)、EDCI(73 mg,0.38 mmol)和HOBT(51 mg,0.38 mmol),室温下反应8 h。反应完后,加水(200 ml)稀释,并用DCM(50 ml × 3)萃取,收集有机层,使用无水硫酸钠干燥,蒸干溶剂,硅胶柱色谱分离(DCM:MeOH = 98:2),得淡黄色油状液体(2)91 mg,产率71%;1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 1.42-1.48 (m, 2H), 1.53-1.59 (m, 2H), 1.62 (s, 3H), 2.32-2.34 (m, 2H), 2.41 (d, J=0.6 Hz, 3H), 2.59 (s, 3H), 3.04-3.09 (m, 1H), 3.12-3.19 (m, 2H), 3.22-3.28 (m, 1H), 3.57 (s, 3H), 4.49-4.51 (m, 1H), 7.40-7.45 (m, 2H), 7.47-7.51 (m, 2H), 8.19-8.21 (m, 1H)。

      N-((R)-1-(3-苄基-7-氯-4-氧代-3, 4-二氢喹唑啉-2-基)-2-甲基丙基)-N-(3-(5-(2-((S)-4-(4-氯苯基)-2, 3, 9-三甲基-6H-噻吩并[3, 2-f][1, 2, 4]三唑并[4, 3-a][1, 4]二氮杂卓-6-基)乙酰胺基)戊酰胺基丙基)-4-甲基苯甲酰胺(4)的制备:

      将化合物2(91 mg,0.18 mmol)溶于THF-MeOH-H2O(3∶2∶1)混合溶剂(6 ml),加入LiOH(17 mg,0.72 mmol),室温反应5 h后蒸干溶剂,使用1 mol/L稀盐酸调pH至6,过滤,收集固体并干燥,得白色固体49 mg(0.10 mmol);将所得白色固体(49 mg,0.10 mmol)溶于DCM(15 ml),加入EDCI(29 mg,0.15 mmol)、HOBT(20 mg,0.15 mmol)和ispinesib(0.10 mmol,52 mg),室温反应8 h后,加水(300 ml)稀释,用DCM(100 ml × 3)萃取,收集有机层,使用无水硫酸钠干燥,蒸干溶剂,C18反相柱色谱分离(MeOH∶H2O=63∶37),得白色固体59 mg(4,0.06 mmol),两步收率33%;1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 0.49 (d, J=6.2 Hz, 3H), 0.82-0.86 (m, 1H), 0.91 (d, J=6.4 Hz, 3H), 1.23-1.29 (m, 3H), 1.31-1.36 (m, 4H), 1.63 (d, J=1.7 Hz, 3H), 1.77-1.90 (m, 2H), 2.34 (s, 3H), 2.42 (s, 3H), 2.61 (s, 3H), 2.71-2.78 (m, 1H), 3.02 (s, 1H), 3.09-3.14 (m, 1H), 3.15-3.20 (m, 1H), 3.23-3.30 (m, 3H), 4.50-4.52 (m, 1H), 5.02-5.13 (m, 1H), 5.55 (d, J=10.6 Hz, 1H), 5.89 (d, J=16.0 Hz, 1H), 7.17-7.29 (m, 6H), 7.33 (d, J=7.3 Hz, 1H), 7.35-7.40 (m, 3H), 7.42 (d, J=8.3 Hz, 2H), 7.47-7.51 (m, 2H), 7.66-7.68 (m, 1H), 7.81 (t, J=1.7 Hz, 1H), 8.17 (s, 1H), 8.23-8.26 (m, 1H) ;13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 11.7, 13.1, 14.5, 18.6, 20.0, 21.4, 23.1, 28.8, 29.3, 29.5, 30.7, 35.4, 36.2, 38.1, 38.7, 42.9, 45.6, 54.3, 59.4, 119.5, 126.3, 126.9, 127.1, 127.9, 128.5, 128.9, 129.1, 129.3, 130.0, 130.3, 130.6, 131.1, 132.7, 134.2, 135.6, 137.2, 137.2, 139.1, 140.0, 147.6, 150.2, 155.6, 155.7, 161.6, 163.4, 169.8, 171.9, 172.4;HRMS(ESI) m/z calcd for C54H56Cl2N9O4S (M-H) 996.3559, found 996.3542;熔程:143.1~146.3 ℃

      图  4  化合物5和6合成路线

      S)-6-(2-(4-(4-氯苯基)-2, 3, 9-三甲基-6H-噻吩并[3, 2-f][1, 2, 4]三唑并[4, 3-a][1, 4]二氮杂卓-6-基)乙酰氨基)己酸乙酯(4a)的制备:

      将JQ1-1(100 mg,0.25 mmol)溶解于DCM(10 ml),加入化合物6-氨基己酸甲酯(3a,44 mg,0.30 mmol)、EDCI(73 mg,0.38 mmol)和HOBT(51 mg,0.38 mmol),室温反应8 h。反应完后,加水(200 ml)稀释,并用DCM(50 ml × 3)萃取,收集有机层,使用无水硫酸钠干燥,蒸干溶剂,硅胶柱色谱分离(DCM:MeOH = 98:2),得淡黄色油状液体(4a)80 mg,产率59%;1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 1.15-1.18 (m, 3H), 1.25 (s, 1H), 1.32 (s, 1H), 1.41-1.48 (m, 2H), 1.51-1.56 (m, 2H), 1.62 (s, 3H), 2.25-2.27 (m, 2H), 2.41 (s, 3H), 2.59 (s, 3H), 3.02-3.08 (m, 1H), 3.10-3.20 (m, 2H), 3.22-3.28 (m, 1H), 4.02-4.06 (m, 2H), 4.49-4.51 (m, 1H), 7.38-7.44 (m, 2H), 7.45-7.51 (m, 2H), 8.16-8.18 (m, 1H)。

      S)-7-(2-(4-(4-氯苯基)-2, 3, 9-三甲基-6H-噻吩并[3, 2-f][1, 2, 4]三唑并[4, 3-a][1, 4]二氮杂卓-6-基)乙酰氨基)庚酸乙酯(4b)的制备:

      中间体4b的合成步骤参照中间体4a合成,得淡黄色油状液体(4b)99 mg,产率76%;1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 1.15-1.17 (m, 3H), 1.26-1.31 (m, 4H), 1.39-1.46 (m, 2H), 1.47-1.54 (m, 2H), 1.62 (s, 3H), 2.25-2.27 (m, 2H), 2.41 (s, 3H), 2.59 (s, 3H), 3.02-3.08 (m, 1H), 3.10-3.20 (m, 2H), 3.22-3.28 (m, 1H), 4.02-4.05 (m, 2H), 4.49-4.51 (m, 1H), 7.38-7.44 (m, 2H), 7.46-7.51 (m, 2H), 8.15-8.17 (m, 1H)。

      N-((R)-1-(3-苄基-7-氯-4-氧代-3, 4-二氢喹唑啉-2-基)-2-甲基丙基)-N-(3-(6-(2-((S)-4-(4-氯苯基)-2, 3, 9-三甲基-6H-噻吩并[3, 2-f][1, 2, 4]三唑并[4, 3-a][1, 4]二氮杂卓-6-基)乙酰胺基)己酰胺基)丙基)-4-甲基苯甲酰胺(5)的制备:

      将化合物4a(80 mg,0.15 mmol)溶于THF-MeOH-H2O(3∶2∶1)混合溶剂(6 ml),加入LiOH(14 mg, 0.6 mmol),室温反应5 h后蒸干溶剂,使用1 mol/L稀盐酸调pH至6,过滤,收集固体并干燥,得白色固体61 mg(0.12 mmol);将所得白色固体(61 mg,0.12 mmol)溶于 DCM(15 ml)中,加入EDCI(35 mg,0.18 mmol)、HOBT(24 mg,0.18 mmol)和化合物ispinesib(0.12 mmol,62 mg),室温下反应8 h后,加水(300 ml)稀释,并用DCM(100 ml × 3)萃取,收集有机层,使用无水硫酸钠干燥,蒸干溶剂, C18反相柱色谱分离(MeOH∶H2O=63∶37),得白色固体64 mg(5,0.06 mmol),两步收率42%;1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 0.48 (d, J=5.9 Hz, 3H), 0.80-0.87 (m, 1H), 0.90 (d, J=6.6 Hz, 3H), 1.14-1.22 (m, 2H), 1.23-1.36 (m, 4H), 1.37-1.43 (m, 2H), 1.62 (s, 3H), 1.71-1.85 (m, 2H), 2.33 (s, 3H), 2.41 (s, 3H), 2.52-2.54 (m, 1H), 2.60 (d, J=1.3 Hz, 3H), 2.69-2.77 (m, 1H), 3.00-3.06 (m, 1H), 3.08-3.11 (m, 1H), 3.15-3.21 (m, 1H), 3.21-3.29 (m, 3H), 4.50-4.52 (m, 1H), 5.05 (d, J=16.5 Hz, 1H), 5.54 (d, J=10.3 Hz, 1H), 5.88 (d, J=16.1 Hz, 1H), 7.19-7.28 (m, 6H), 7.29-7.33 (m, 1H), 7.34-7.39 (m, 3H), 7.42 (d, J=7.9 Hz, 1H), 7.42-7.42 (m, 1H), 7.45-7.51 (m, 2H), 7.64-7.68 (m, 1H), 7.79 (d, J=1.8 Hz, 1H), 8.17 (t, J=5.6 Hz, 1H), 8.23 (d, J=8.6 Hz, 1H);13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 11.7, 13.1, 14.5, 18.6, 20.0, 21.4, 25.3, 26.6, 28.8, 29.5, 30.7, 35.7, 36.2, 38.1, 38.9, 42.9, 45.6, 54.4, 59.4, 119.5, 126.3, 126.9, 127.1, 127.9, 128.5, 128.9, 129.1, 129.3, 130.0, 130.3, 130.6, 131.2, 132.7, 134.3, 135.7, 137.2, 137.2, 139.1, 140.0, 147.6, 150.2, 155.6, 155.7, 161.6, 163.4, 169.7, 172.0, 172.5;HRMS(ESI) m/z calcd for C55H59Cl3N9O4S (M+Cl) 1046.3482, found 1046.3443;熔程:143.0~145.2 ℃。

      N-((R)-1-(3-苄基-7-氯-4-氧代-3, 4-二氢喹唑啉-2-基)-2-甲基丙基)-N-(3-(7-(2-((S)-4-(4-氯苯基)-2, 3, 9-三甲基-6H-噻吩并[3, 2-f][1, 2, 4]三唑并[4, 3-a][1, 4]二氮杂卓-6-基)乙酰胺基)庚酰胺基)丙基)-4-甲基苯甲酰胺(6)的制备:

      化合物6的合成步骤参照化合物5合成,得白色固体71 mg(6,0.07 mmol),两步收率36%;1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 0.47 (d, J=6.2 Hz, 3H), 0.81-0.87 (m, 1H), 0.89 (d, J=6.6 Hz, 3H), 1.13-1.19 (m, 2H), 1.22-1.27 (m, 3H), 1.28-1.35 (m, 3H), 1.38-1.43 (m, 2H), 1.61 (s, 3H), 1.71-1.83 (m, 2H), 2.33 (s, 3H), 2.41 (s, 3H), 2.53 (s, 1H), 2.59 (s, 3H), 2.69-2.77 (m, 1H), 3.02-3.07 (m, 1H), 3.09-3.16 (m, 1H), 3.17-3.21 (m, 1H), 3.21-3.28 (m, 3H), 4.50-4.52 (m, 1H), 5.05 (d, J=16.3 Hz, 1H), 5.54 (d, J=10.5 Hz, 1H), 5.88 (d, J=16.1 Hz, 1H), 7.19-7.27 (m, 6H), 7.28-7.33 (m, 1H), 7.34-7.39 (m, 3H), 7.40-7.44 (m, 2H), 7.46-7.50 (m, 2H), 7.65-7.67 (m, 1H), 7.79 (d, J=2.0 Hz, 1H), 8.17 (t, J=5.6 Hz, 1H), 8.23 (d, J=8.6 Hz, 1H) ;13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 11.7, 13.1, 14.5, 19.0, 20.0, 21.4, 25.5, 26.6, 28.8, 28.9, 29.5, 29.6, 30.7, 35.7, 36.2, 38.1, 38.9, 42.9, 45.6, 54.4, 59.4, 119.5, 126.3, 126.9, 127.1, 127.9, 128.5, 128.9, 129.1, 129.3, 130.0, 130.3, 130.5, 131.2, 132.7, 134.3, 135.7, 137.2, 137.2, 139.1, 140.0, 147.6, 150.2, 155.6, 155.7, 161.6, 163.4, 169.7, 172.0, 172.4;HRMS(ESI) m/z calcd for C56H61Cl2N9O4SNa (M+Na)+ 1048.3836, found 1048.3892;熔程:142.0~144.7 ℃。

      化合物7、8合成路线如图5所示。

      图  5  化合物7、8合成路线

      R)-(9-((3-(N-(1-(3-苄基-7-氯-4-氧代 -3, 4-二氢喹唑啉 -2-基)-2-甲基丙基)-4-甲基苯甲酰胺基)丙基)氨基)-9-氧代壬基)氨基甲酸叔丁酯(6a)的制备:

      将ispinesib(100 mg,0.2 mmol)溶解于DCM(10 ml)中,加入化合物9-((叔丁氧基羰基)氨基)壬酸(5a,66 mg,0.24 mmol),EDCI(58 mg,0.30 mmol)和HOBT(41 mg,0.30 mmol),室温下反应8 h。反应完后,加水(200 ml)稀释,并用DCM(50 ml × 3)萃取,收集有机层,使用无水硫酸钠干燥,蒸干溶剂,硅胶柱色谱分离(DCM∶MeOH = 98∶2),得淡黄色油状液体(6a)93 mg,产率60%;1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 0.47 (d, J=6.2 Hz, 3H), 0.81-0.86 (m, 1H), 0.89 (d, J=6.8 Hz, 3H), 1.07-1.31 (m, 13H), 1.35-1.40 (m, 9H), 1.70-1.81 (m, 2H), 2.33 (s, 3H), 2.46-2.49 (m, 1H), 2.52 (s, 1H), 2.70-2.74 (m, 1H), 2.86-2.89 (m, 2H), 3.22-3.24 (m, 2H), 5.05 (d, J=16.3 Hz, 1H), 5.53 (d, J=10.5 Hz, 1H), 5.88 (d, J=16.1 Hz, 1H), 6.73-6.75 (m, 1H), 7.19-7.27 (m, 6H), 7.28-7.31 (m, 1H), 7.32-7.38 (m, 3H), 7.64-7.66 (m, 1H), 7.77 (d, J=2.0 Hz, 1H), 8.22 (d, J=8.4 Hz, 1H)。

      R)-(10-((3-(N-(1-(3-苄基-7-氯-4-氧代 -3, 4-二氢喹唑啉 -2-基)-2-甲基丙基)-4-甲基苯甲酰胺基)丙基)氨基)-9-氧代壬基)氨基甲酸叔丁酯(6b)的制备:

      中间体6b的合成步骤参照中间体6a合成,得淡黄色油状液体(6b)82 mg,产率52%;1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 0.47 (d, J=6.2 Hz, 3H), 0.79-0.85 (m, 1H), 0.89 (d, J=6.8 Hz, 3H), 1.09-1.34 (m, 15H), 1.36 (s, 9H), 1.68-1.81 (m, 2H), 2.33 (s, 3H), 2.48 (s, 1H), 2.52 (d, J=2.0 Hz, 1H), 2.70-2.74 (m, 1H), 2.84-2.91 (m, 2H), 3.19-3.27 (m, 2H), 5.04 (d, J=16.7 Hz, 1H), 5.53 (d, J=10.5 Hz, 1H), 5.87 (d, J=16.7 Hz, 1H), 6.71-6.78 (m, 1H), 7.18-7.38 (m, 9H), 7.28-7.28 (m, 1H), 7.65-7.66 (m, 1H), 7.78 (d, J=2.0 Hz, 1H), 8.22 (d, J=8.6 Hz, 1H)。

      N-((R)-1-(3-苄基-7-氯-4-氧代-3, 4-二氢喹唑啉-2-基)-2-甲基丙基)-N-(3-(9-(2-((S)-4-(4-氯苯基)-2, 3, 9-三甲基-6H-噻吩并[3, 2-f][1, 2, 4]三唑并[4, 3-a][1, 4]二氮杂卓-6-基)乙酰胺基)壬酰胺基)丙基)-4-甲基苯甲酰胺(7)的制备:

      将化合物6a(93 mg,0.12 mmol)溶于DCM(3 ml)中,加入CF3COOH(1 ml),室温反应4 h后蒸干溶剂,得无色油状液体73 mg(0.11 mmol);将所得无色油状液体(73 mg,0.11 mmol)溶于DCM(15 ml)中,加入EDCI(31 mg,0.16 mmol)、HOBT(22 mg,0.16 mmol)和化合物JQ1-1(0.11 mmol,44 mg),室温下反应8 h,加水(300 ml)稀释,并用DCM(100 ml × 3)萃取,收集有机层,使用无水硫酸钠干燥,蒸干溶剂,C18反相柱色谱分离(MeOH∶H2O = 68∶32),得白色固体53 mg(7,0.05 mmol),两步收率46%;1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 0.49 (d, J=6.2 Hz, 3H), 0.82-0.89 (m, 1H), 0.91 (d, J=6.8 Hz, 3H), 1.11-1.17 (m, 2H), 1.18-1.36 (m, 11H), 1.41-1.49 (m, 2H), 1.63 (s, 3H), 1.72-1.84 (m, 2H), 2.34 (s, 3H), 2.42 (s, 3H), 2.61 (s, 3H), 2.70-2.77 (m, 1H), 3.04-3.16 (m, 2H), 3.17-3.22 (m, 1H), 3.23-3.30 (m, 3H), 4.51-4.53 (m, 1H), 5.06 (d, J=16.3 Hz, 1H), 5.55 (d, J=10.6 Hz, 1H), 5.89 (d, J=16.0 Hz, 1H), 5.88-5.88 (m, 1H), 7.21-7.29 (m, 6H), 7.30-7.34 (m, 1H), 7.35-7.39 (m, 3H), 7.42-7.46 (m, 2H), 7.47-7.50 (m, 2H), 7.66-7.68 (m, 1H), 7.80 (d, J=1.8 Hz, 1H), 8.19 (t, J=5.5 Hz, 1H), 8.24 (d, J=8.6 Hz, 1H) ;13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 11.7, 13.1, 14.5, 18.6, 20.0, 21.4, 25.6, 26.9, 28.8, 29.1, 29.2, 29.7, 30.7, 35.7, 36.2, 38.1, 38.9, 42.9, 45.6, 54.4, 59.4, 119.5, 126.3, 126.9, 127.1, 127.9, 128.5, 128.9, 129.1, 129.3, 130.0, 130.3, 130.6, 131.2, 132.7, 134.3, 135.7, 137.1, 137.2, 139.1, 139.9, 147.6, 150.2, 155.6, 155.7, 161.6, 163.4, 169.8, 172.0, 172.5;HRMS(ESI) m/z calcd for C58H66Cl2N9O4S (M+H)+ 1054.433, found 1054.4367;熔程:134.7~139.1 ℃。

      N-((R)-1-(3-苄基-7-氯-4-氧代-3, 4-二氢喹唑啉-2-基)-2-甲基丙基)-N-(3-(10-(2-((S)-4-(4-氯苯基)-2, 3, 9-三甲基-6H-噻吩并[3, 2-f][1, 2, 4]三唑并[4, 3-a][1, 4]二氮杂卓-6-基)乙酰胺基)癸酰胺基)丙基)-4-甲基苯甲酰胺(8)的制备:

      化合物8的合成步骤参照化合物7合成,得白色固体47 mg,两步收率49%;1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 0.49 (d, J=6.2 Hz, 3H), 0.82-0.88 (m, 1H), 0.91 (d, J=6.8 Hz, 3H), 1.08-1.36 (m, 16H), 1.42-1.47 (m, 2H), 1.63 (s, 3H), 1.72-1.83 (m, 1H), 2.34 (s, 3H), 2.42 (s, 3H), 2.61 (s, 3H), 2.71-2.77 (m, 1H), 3.03-3.10 (m, 1H), 3.11-3.16 (m, 1H), 3.17-3.20 (m, 1H), 3.22-3.29 (m, 3H), 4.51-4.53 (m, 1H), 5.06 (d, J=16.5 Hz, 1H), 5.55 (d, J=10.6 Hz, 1H), 5.89 (d, J=16.0 Hz, 1H), 7.21-7.28 (m, 6H), 7.30-7.34 (m, 1H), 7.34-7.40 (m, 3H), 7.42-7.46 (m, 2H), 7.48-7.50 (m, 2H), 7.66-7.68 (m, 1H), 7.80 (d, J=1.8 Hz, 1H), 8.18 (t, J=5.6 Hz, 1H), 8.24 (d, J=8.6 Hz, 1H) ;13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 11.7, 13.1, 14.5, 18.6, 20.0, 21.4, 25.6, 26.9, 28.8, 29.2, 29.2, 29.3, 29.4, 29.7, 30.7, 35.7, 36.2, 38.1, 38.9, 42.9, 45.6, 54.4, 59.5, 70.2, 119.6, 126.3, 126.9, 127.1, 127.9, 128.5, 128.9, 129.1, 129.3, 130.0, 130.3, 130.6, 131.2, 132.7, 134.3, 135.7, 137.2, 137.2, 139.1, 139.9, 147.6, 150.2, 155.6, 155.7, 161.6, 163.4, 169.8, 172.0, 172.5;HRMS(ESI) m/z calcd for C59H68Cl2N9O4S (M+H)+ 1068.4487, found 1068.4488;熔程:132.9~138.5 ℃。

    • 将细胞以4×105个/孔的密度接种于6孔板中,培养24 h;根据实验需要,选取相应浓度的PAGE凝胶快速制备试剂盒,取40 μg总蛋白及5 μl蛋白marker上样,恒压120 V电泳90 min;然后恒流300 mA 转膜180 min转至PVDF膜上;转膜结束后,根据marker剪下目的条带,配制无蛋白快速封闭液(5×)封闭30 min;用TBST清洗残留封闭液,用5% BSA稀释相应一抗,4 ℃摇床孵育过夜;用TBST 洗膜3次,每次10min;使用荧光兔二抗,室温孵育1 h; 用TBST 洗膜3次,每次5 min;最后在Biorad ChemiDoc成像仪下拍照。

    • Western Blot结果表明,Linker长度与化合物降解活性密切相关,Linker长度为4个碳原子长度时(化合物4),BRD4降解活性最强。化合物4在HCT116、MDA-MB-231、Hela和A549四种肿瘤细胞中均表现出下调BRD4蛋白水平的活性,而其他化合物在10 μmol/L与1 μmol/L浓度下对胞内BRD4蛋白水平均无明显影响(图6)。

      图  6  目标化合物降解BRD4蛋白

    • 基于ATTEC策略,我们设计并成功合成5个BRD4-ATTEC分子,所有目标化合物均经过了核磁和质谱结构确证,纯度均高于95%。在蛋白降解活性测试中,我们发现化合物4在10 μmol/L浓度下对4种肿瘤细胞均显示出诱导BRD4蛋白降解活性,表现出广谱有效的特征,为后续BRD4自噬降解的设计和结构优化提供了有效的先导化合物。本研究验证了ATTEC策略能有效诱导BRD4蛋白降解,并获得BRD4自噬降解剂先导化合物,拓展了靶向自噬降解的适用范围,后续的结构优化研究尚在进展之中。

参考文献 (10)

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